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慧眼識珠看伯樂CFX connect實時熒光定量PCR儀
伯樂CFX Connect 是繼CFX96 Touch之后,在2012年推出的具有三個熒光檢測通道的基礎(chǔ)型實時熒光定量PCR儀(注:CFX Connect已于2022年5月停產(chǎn),由新款CFX Duet取代)。它沿用了伯樂熒光信號光學(xué)檢測單元、PCR熱循環(huán)反應(yīng)模塊二合一結(jié)構(gòu)設(shè)計,可實現(xiàn)在一個循環(huán)中進行2重?zé)晒釶CR反應(yīng)(multiplex real-time PCR assay, multiplex quantitative PCR, multiplex qPCR和羅氏 FRET雙雜交熒光探針檢測??捎糜诤怂岫浚╪ucleic acid quantification,如SARS-CoV-2感染篩查與診斷)、基因表達水平分析(gene expression analysis)、基因突變檢測(如常用的SNP、CNV、QTL)、轉(zhuǎn)基因檢測(genetically modified organism,簡稱GMO,如檢測轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花等)及PCR擴增產(chǎn)物的特異性驗證分析(melt curve analysis、HRM assay)等多種研究應(yīng)用。
CFX Connect所用的96×0.2mL PCR模塊的最大升溫降溫速度、模塊內(nèi)溫度均一性、溫度準確度、退火溫度梯度優(yōu)化功能等PCR反應(yīng)模塊關(guān)鍵技術(shù)性能,與伯樂CFX96、CFX96 Touch 實時熒光定量PCR系統(tǒng)所用的反應(yīng)模塊保持一致,與AB 7500 Fast(96×0.1mL)、QuantStudio 5(96×0.2mL)和QuantStudio 6 Pro(96×0.2mL)的常用配置一致或接近。
伯樂-AB主流qPCR儀主要技術(shù)性能指標對比
品牌 | Bio-Rad | Applied Biosystems(AB) | |||
型號 | CFX Connect | CFX Opus 96 | 7500 Fast | QuantStudio 5 | QuantStudio 6 Pro |
熒光檢測通道數(shù) | 2熒光+ FRET | 5熒光+ FRET | 5組藕聯(lián)通道 | 6組解耦通道 | 5組藕聯(lián)通道 |
檢測靈敏度 | 1拷貝人基因組基因模板 | 1拷貝RNaseP模板 | |||
檢測線性動態(tài)范圍 | 10個數(shù)量級 | 9個數(shù)量級 | 10個數(shù)量級 | ||
PCR樣品通量 | 96×0.2mL Low profile(10~30μL) | 96×0.1mL (10~30μL) | 96×0.2mL (10~100μL) | ||
PCR升溫速率 | 最快5℃/sec,平均3.3℃/sec | 5.5℃?sec | 6.5℃/sec | ||
PCR控溫精度 | ±0.2℃(target at 90℃) | ±0.5℃ | ±0.25℃ | ||
PCR溫度均一性 | ±0.4℃(10秒內(nèi)達到90℃ | ±1℃ | ±0.4℃ | ||
退火溫度梯度設(shè)定 | 8個溫度梯度 | 6個溫度梯度 | 6個溫度梯度 | 3個溫度梯度 |
從熒光檢測模塊類型看,CFX Connect、CFX96、CFX96 Touch和2020年新上市CFX Opus 96,都采用可移動、逐孔掃描的光梭式檢測單元。讀取熒光信號時,設(shè)定的熒光通道由光梭牽引動到每個反應(yīng)孔中心正上方并短暫懸停,完成熒光激發(fā)和反應(yīng)孔內(nèi)樣品發(fā)射熒光信號收集。光梭式檢測模式消除了反應(yīng)孔間的熒光交叉干擾(Cross-talk)和不同反應(yīng)孔與熒光探頭之間的角度和光程差。因此,反應(yīng)板不同位置的熒光測試信號無需ROX染料校正。這一點,所有CFX系列熒光定量系統(tǒng)相通。
就檢測的靈敏度、動態(tài)范圍、可重復(fù)性這些關(guān)鍵性能而言,CFX Connect與CFX Opus 96、7500 Fast、QuantStudio 5、QuantStudio 6 Pro等多熒光通道平臺,并無本質(zhì)差異。
CFX96、CFX96 Touch和CFX Opus 96配置的是6個熒光檢測通道(5熒光+1 FRET專用通道),而CFX Connect的檢測通道僅3個(2熒光+1 FRET通道)。但高低兩種光學(xué)配置的CFX系統(tǒng),都有效支持SYBR Green I染料、TaqMan熒光探針(FAM、VIC、TET、HEX、CAL Fluor、Gold 540、Cal Fluor和Orange 560)、Molecular Beacon探針和1種FRET探針實驗應(yīng)用。對實驗者而言,CFX Connect檢測通道數(shù)量減少,犧牲的是多重實時熒光定量PCR分析中每個循環(huán)中可檢測靶標的容量(單管內(nèi)可同時測定的熒光探針標記靶標種數(shù)從3-5種降低為2種)。但CFX Connect系統(tǒng)依然可以進行FAM靶標+VIC內(nèi)參組合這種最常見的雙重實時熒光定量分析(duplex qPCR)。而CFX Opus 96、7500 Fast、QuantStudio 5、QuantStudio 6 Pro這類多熒光通道配置平臺理論上可勝任三重、四重的多色熒光定量分析任務(wù),這對于臨床醫(yī)學(xué)、流行病學(xué)中呼吸道、消化道感染性疾病復(fù)雜病原菌的快速鑒別固然有利。但眾所周知,3重及更多種靶標的多重定量反應(yīng)實驗,反應(yīng)體系的優(yōu)化與特異性、靈敏度驗證工作十分繁瑣和復(fù)雜,絕非科研實驗等閑事宜(多重實時熒光定量分析的涵義與應(yīng)用意義和實施方法的問題,可參考《如何用MIQE標準指導(dǎo)多重實時熒光定量PCR實驗的流程與驗證設(shè)計?-上》)。從時間-效率比角度來說,CFX Connect的雙重?zé)晒舛糠治龉δ苁峭耆珜嵱?、夠用的。這一點,目前已有大量實驗論文可以證實(可參考《美人首飾侯王印盡是沙中浪底來——牛人用伯樂CFX connect實時熒光定量PCR儀都干了啥?-上》一文)。
退一步說,對于特殊類型研究課題,確需開展單管內(nèi)多種模板測定分析時,另辟蹊徑,引入新型Green核酸染料高分辨率熔解曲線分析技術(shù)路線,CFX Duet完成5重以上的多重?zé)晒舛糠治鲆彩峭耆梢詫崿F(xiàn)的。
至于CFX Connect實時熒光定量PCR儀明明配置了3個檢測通道數(shù),為何只能進行2色熒光同步檢測的問題,可參考《實時熒光定量PCR儀熒光檢測通道數(shù)量的內(nèi)涵淺析》一文,在此不作贅述。