應(yīng)用驅(qū)動型qPCR儀選型攻略-3

       實時熒光定量 PCR 儀的熒光檢測單元通常包括了寬譜基礎(chǔ)光源、入射激發(fā)光模塊、發(fā)射熒光模塊和熒光信號采集數(shù)碼相機等基本組件。針對特定熒光基團的光吸收、熒光發(fā)射光譜特征，將最適的激發(fā)光濾鏡模塊、發(fā)射光濾鏡模塊藕聯(lián)，組成了波長范圍固定的光學(xué)通道用于采集熒光信號。每一色熒光對應(yīng)一個專用通道，如FAM/SYBR GREEN青-綠色光通道、VIC/HEX/TET綠-黃綠通道等，可確保檢測靈敏度與準確性。

       曾經(jīng)，人們把熒光定量PRC儀內(nèi)部這樣一個光學(xué)通道稱為一“色”，并按通道配置數(shù)量在儀器名稱中加以區(qū)分。如1995年推出的ABI PRISM 7700 Sequence Detection System實時熒光定量PCR儀，配有FAM, JOE, HEX及TET四個檢測通道，稱為4色定量PCR儀。DNA Engine Opticon 2只配置了用于SYBR Green I /FAM、HEX/TET/ VIC/TAMRA兩種波長熒的光檢測通道，故名Two-Color Real-Time PCR Detection System。如今，新型qPCR儀諸如QuantiStudio 5、QuantiStudio 7 Pro，CFX96-touch、CFX Opus 96、LightCycler 480 II等，熒光檢測通道數(shù)量達到6個，卻不見人用6色實時定量PCR儀來冠名。

       是什么削弱了熒光定量PCR系統(tǒng)檢測通道的數(shù)量與可檢測熒光色數(shù)之間的聯(lián)系？6通道qPCR儀能進行6色熒光的檢測嗎？

一、ROX參比熒光校正占用了屈指可數(shù)的熒光檢測通道資源

       對于qPCR定量實驗中引入ROX參比熒光對報告基團熒光信號及非PCR反應(yīng)造成的熒光信號波動均一化（Normalization）的必要性，業(yè)內(nèi)外歷來是仁智互見、各執(zhí)一詞。

1.1 qPCR實驗ROX校正有用論

       支持加入ROX參比熒光校正者認為，在實時熒光定量PCR實驗中應(yīng)用ROX熒光染料的意義，至少有4個方面：

       1.1.1 校準各孔反應(yīng)體系構(gòu)建時PCR組份移液加樣操作誤差，消除反應(yīng)濃度或體積變化引起的孔間熒光信號強度波動；

       1.1.2 將同一次運行中全部報告熒光基團信號的強度均一化，校正不同位置反應(yīng)孔釋放的熒光信號因與CCD間光程不同引起的強度誤差；

       1.1.3 消除儀器檢測器本身噪音引起的熒光信號波動，同時為多重實時熒光定量PCR分析提供穩(wěn)定基線；

       1.1.4 ROX染料不干擾實時熒光定量PCR反應(yīng)擴增效率和特異性、報告熒光基團的信號檢測。

       TaqMan Universal PCR Master Mix（TaqMan 通用實時熒光定量PCR預(yù)混試劑）、TaqMan Fast Advanced 預(yù)混液中都含有ROX染料。讀取ROX校正熒光信號要單獨占用一個檢測通道，則待測試樣品檢測探針不能采用與ROX具有相同光譜特征的報告熒光染料，結(jié)果必然是樣品可用的熒光信號采集通道減少一個。這在multiplex多色熒光定量實驗設(shè)計中尤其重要。使用4通道的StepOnePlus熒光定量PCR儀最多能在單管內(nèi)進行同時擴增3個靶序列。若要完成4重PCR定量分析（quadruplex qPCR assays），就需采用像7500、7500Fast、QuantiStudio 5、QuantiStudio 6/7Pro、QuantiStudio 6/7 Flex 和CFX 96 Touch、CFX Opus 96等配置更多色熒光通道的平臺上進行。

1.2 qPCR實驗ROX校正無用論

       也該觀點的認為熒光定量PCR實驗中引入ROX參比熒光校正毫無意義。

       理由主要是：

       1.2.1 定量實驗的反應(yīng)體系包括了通用PCR擴增預(yù)混試劑、正反向引物對、探針、樣本或標準模板在內(nèi)多種組份。對組份的加樣操作誤差是客觀存在的，幾乎是每一輪組份的加樣移液，本質(zhì)上都是在引入并不斷積累誤差。

       以PCR實驗常用的微量移液器為例，視單次移液量和所用的移液器規(guī)格不同，每次操作都可能存在1-2.5%甚至更高的系統(tǒng)誤差、0.3-1.5%的隨機誤差。

表1 常用單道可調(diào)量程微量移液器加樣誤差表

（數(shù)據(jù)來源于eppendorf官網(wǎng)）

       事實上，反應(yīng)組份越復(fù)雜、手工操作次數(shù)越多，系統(tǒng)誤差、隨機誤差和人為操作精度誤差綜合后必造成各反應(yīng)孔最終擴增體系的體積、組份濃度的細微區(qū)別。通過改進操作儀器精度、操作熟練程度、提高PCR反應(yīng)體系構(gòu)建的自動化程度，誤差固然可以縮小。但移液加樣誤差單靠PCR預(yù)混試劑中ROX信號強度歸一化是無法有效消除的。大量實驗也證明，即便依然存在誤差，只要控制在一定范圍內(nèi)，不會對實驗結(jié)果產(chǎn)生根本性影響。因此，添加ROX組份可視作一種無用功。

       1.2.2 不同品牌型號實時熒光定量PCR儀的光學(xué)檢測單元結(jié)構(gòu)設(shè)計存在區(qū)別，對采用ROX信號校正PCR反應(yīng)板各孔熒光信號光程誤差的必要性是完全不同的。

       伯樂CFX 96-touch、CFX Opus 實時熒光定量PCR儀的光學(xué)檢測系統(tǒng)為光梭式設(shè)計（optics shuttle）。光梭移動呈現(xiàn)“弓”字形軌跡，從A1 →A12 →B12 →B2 →C3 →C12……直至H12走完整板全部96個反應(yīng)孔。

        當(dāng)采集某一孔的某種熒光信號時，光梭中的步進馬達驅(qū)動特定光學(xué)通道移到被檢測PCR孔正上方精確對焦，再啟動激發(fā)、熒光信號采集。不同檢測通道、不同反應(yīng)孔是等距掃描和信號采集，不存在反應(yīng)孔間熒光光程和誤差問題，故無需引入ROX校正。

       既然無需ROX參比熒光，則與之對應(yīng)的560-590nm波長檢測通道就可用作Texas Red/CAL Fluor Red 610這類報告熒光探針檢測信號采集。在伯樂CFX Opus 96 real time PCR Detection system可選擇FAB、HEX/VIC、Texsa Red、CY5和CY5.5組合完成分別用5種顏色標記探針實施5個靶基因的同步檢測。

       對引入ROX參比信號校正存在的截然相反意見且各自所指導(dǎo)的qPCR實驗已踐行多年，故qPCR儀運行編程界面都有ROX設(shè)置選項，便于實驗者基于自身經(jīng)驗和試劑使用說明自由決定。

       因此，不同品牌型號qPCR儀，如Applied Biosystems 7500 VS  Stratagene_Mx3500P，雖均為5個檢測通道，但在實際使用中，因不同實驗、不同探針和配套試劑不同，在Multiplex多色定量分析中可同時檢測的靶標種數(shù)可能不同。

        簡單地將系統(tǒng)檢測通道數(shù)量與Multiplex反應(yīng)中熒光色數(shù)掛鉤劃等號不僅沒有意義，反而有犯錯的風(fēng)險。

二、FRET探針檢測引入使qPCR儀多色熒光檢測通道“灌水”

       羅氏LightCycle系列 FRET探針，又稱雙雜交探針（HybProbe Probes），由兩條分別能與靶片段上下游兩個相距1-5bp的特異結(jié)合位點互補的探針組成。上游探針3`端標記的是熒光素（Fluorescein），作為下游探針熒光能量的供體(Donor)；下游探針5`端標記受體熒光基團，如LightCycle Red 610、LightCycle Red 640和Cy5等，作為FRET效應(yīng)的能量傳導(dǎo)受體(Acceptor)。

       在PCR循環(huán)的復(fù)性階段，兩條探針同時結(jié)合到靶片段上。上游探針末端供體基團被入射光激發(fā)產(chǎn)生熒光。此時因供、受體基團緊緊相鄰而發(fā)生FRET反應(yīng)，受體基團吸收供體發(fā)出的綠色熒光能量后以波長更長的黃色、橙色或紅色熒光釋放出能量。系統(tǒng)檢測器通過優(yōu)化的濾光片配置，濾除上游供體基團發(fā)射的熒光，只采集下游受體釋放的熒光信號用作分析。

       以LightCycler 480 II的Mono Color HybProbe 檢測模式為例。采用HybProbe Fluorescein (Donor) +LightCycler Red 640 (Acceptor)探針組。采用498nm初始激發(fā)光源激發(fā)供體，釋放510 nm波長的熒光，經(jīng)FERT機制能量被受體吸收后，Red 640煥發(fā)640 nm波長的熒光。而CCD前端配的正是618-660nm帶寬Emission Filter而非常規(guī)FAM/SYBRGreen I檢測通道用的510 nm濾光片，可以有效濾除供體殘余熒光信號。常規(guī)FAM/SYBRGreen I專用熒光通道無法檢測HybProbe探針FRET熒光，而FRET檢測通道只能為HybProbe探針提供專享服務(wù)。

       若要進行FAM和Red 640組合的單管多重實時定量分析，qPCR儀必須同時具備常規(guī)FAM/SYBRGreenI檢測通道和Fluorescein-LightCycler Red 640專用通道。兩種檢測通道的前端入射激發(fā)光模塊相同，但后端發(fā)射熒光濾光模塊不同。本質(zhì)上，F(xiàn)RET檢查波長與常規(guī)TaqMan檢測波長是重疊的。如Red 640專用通道檢測波長的范圍(618-660nm)就與常規(guī)TaqMan探針ROX、Texas-Red所用的紅色熒光波長（623±14nm）基本重疊。兩種探針競爭檢測波長資源，則必然造成因熒光信號竄擾（Cross-talk）而干擾檢測結(jié)果的問題。

        魚（TaqMan等水解型探針）和熊掌（FRET探針）只能二選一：每增加一個FRET專用通道，則要有一個TaqMan信號通道被替換掉。

三、實時熒光定量PCR儀檢測通道與multiplex多色檢測能力的區(qū)別與聯(lián)系

       20多年前，具有超凡遠見卓識的實時熒光定量PCR儀先驅(qū)開創(chuàng)了4熒光檢測通道的配置架構(gòu)，使采用FAM+VIC雙色熒光探針進行單核苷酸多態(tài)性檢測（SNP Assays）和在單管內(nèi)多個基因同步檢測分析（multiplex）方法成為現(xiàn)實。

       系統(tǒng)配置的光學(xué)通道數(shù)量越多，多色熒光檢測應(yīng)用越靈活。

        但檢測通道數(shù)與可同步檢測熒光信號種數(shù)之間既聯(lián)系又有區(qū)別。原因就在于qPCR儀廠商、實驗者對ROX熒光參比校正應(yīng)用、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）探針檢測功能要求的不同。

表2 實時熒光定量PCR儀熒光檢測通道與多重PCR反應(yīng)對比表

       在不引入ROX熒光參比校準情況下，CFX96-touch、CFX Opus 96系統(tǒng)名義上是6個熒光檢測通道，但實際至多可進行5色多重定量檢測，與配置5個熒光通道的7500 Fast系統(tǒng)最大檢測范圍相當(dāng)；而同屬3通道配置經(jīng)濟型實時熒光定量PCR儀，CFX Connet只能進行Duplex，但QuantiStudio 1最多可進行triplex定量分析。

       盡管LightCycler 480 II具有6個檢測通道，但在多重定量模式下，由于FRET探針的上游供體熒光基團Flourescin需占用FAM標記探針激發(fā)通道，同時Flourescin發(fā)射光譜（515-530nm）與VIC/HEX/CAL Fluor Gold 540/Cal Fluor Orange 560/TET等第二個常用熒光通道激發(fā)光譜（515-535 nm）重疊，勢必會削弱FRET探針中Donor激發(fā)能量，因而須關(guān)閉VIC/HEX熒光通道?？梢?，因為熒光激發(fā)通道、檢測通道工作光譜間的嚴重重疊干擾（“內(nèi)卷”？），LightCycler 480系列最多只能進行4重定量檢測（4 Colors Hydrolysis Probes Assay Detection Format）（LightCycler Cyan 500：Ex 440nm/Em 488nm；FAM：Ex 498nm/Em 580nm；LightCycler Red 610：Ex 533nm/Em 610nm；Cy 5/Cy 5.5：Ex 618nm/Em 660nm）。若完全基于FRET探針實施multiplex實驗，最多能執(zhí)行三重定量反應(yīng)（Fluorescein-LightCycler Red 610, Fluorescein-LightCycler Red 640, Fluorescein-Cy 5/Cy 5.5）。

（圖片來源https://lifescience.roche.com/en_cn/articles/lightcycler-480-detection-formats.html）

       可見，曾經(jīng)流行的將檢測通道數(shù)與多重定量PCR熒光色數(shù)直接“藕聯(lián)”形成的“N色實時熒光定量PCR儀”概念已是名不副實、漏洞百出，甚至有混淆誤導(dǎo)視聽之嫌。目前，實時熒光定量PCR儀檢測適用范圍，已不再沿用可檢測幾色熒光的說法，而是用標注系統(tǒng)可支持的報告熒光基團的列表的方式取代。

       討論到這，我們似乎可以回答本文開頭提出的問題了，實時熒光定量PCR儀能用于6色熒光檢測嗎？定性分析是可以的，若不引入ROX熒光校正設(shè)計的話，用于6-target的多重定量檢測也無妨，但如采用的是賽默飛原裝Taqman預(yù)混試劑和探針組合，那只能實現(xiàn)5色定量分析。

參考文獻

ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User′s Manual(904989B,01/2001)

實時熒光定量 PCR 手冊

The LightCycler 480 Real-Time PCR System Brochure(2014)

LightCycler 480 Instrument Operator’s Manual Software Version 1.5

CFX Opus Real-Time System（Bulletin 7279）