一、小CFX Connect實時熒光定量PCR儀在大牛手里表現(xiàn)不俗

       CFX Connect是伯樂CFX系列實時熒光定量PCR儀的基礎產品，可用于2重實時熒光PCR分析和FRET雙雜交探針熒光檢測，2012年3月上市。PubMed數(shù)據(jù)顯示:從美國馬里蘭州陸軍研究實驗室“球狀芽孢桿菌Spo0F H101R突變對菌株適應性的影響(Effect of the Bacillus atrophaeus subsp. globigii Spo0F H101R Mutation on Strain Fitness)”的研究報告公開發(fā)表的2012年11月，到2022年3月的10年間，用CFX connect進行的qPCR實驗總計已發(fā)表論文186篇（剔除預印本平臺已發(fā)表的一篇），其中IFoid分7.0以上期刊發(fā)文總數(shù)45篇（占比近25%）。

表1 部分用CFX Connect實時熒光定量PCR儀開展實驗的研究論文（2015-2022）

二、CFX Connect實時熒光定量PCR儀已開展的研究應用

       單從文章數(shù)量上看，CFX Connect實時熒光定量PCR儀用戶略顯得小眾一些。莫非是因CFX Connect的熒光檢測通道數(shù)量少，限制了其功能應用靈活性的緣故？

       事實并非如此！

       在PubMed上，我們查閱了這186篇正式刊文，對其中qPCR實驗內容部分逐一核實，并按熒光定量分析所直接服務的階段性實驗目標進行歸類。結果顯示，CFX Connect所涉及的實驗應用類型超過13個。按各類別下發(fā)表文章的數(shù)量排序，結果如下。 

1、基因表達水平定量分析（42篇）

       常規(guī)基因表達分析應用包括腫瘤、炎癥、自身免疫疾病、內分泌和代謝疾病等疾病病理狀態(tài)下、應激反應、飲食/藥物/治療干預、環(huán)境脅迫（熱脅迫、電離輻射）、CRISPR介導的基因破壞后、動植物組織細胞及微生物的標志性基因表達水平的變化。

       基因融合（gene fusion）是指因染色體易位、中間缺失或染色體倒置等導致兩個基因部分序列嵌合形成一個新的突變基因。實時熒光定量PCR分析是對融合前原來兩個基因設計特異性引物進行的各基因表達的mRNA進行檢測。奧地利研究人員在對核孔蛋白NUP98的融合蛋白在白血病發(fā)生過程中所處地位的研究中，分別對用慢病毒載體搭載NUP98核孔蛋白- KDM5A組蛋白去甲基化酶5A融合基因轉染的HL-60細胞、急性髓細胞性白血病(AML)小鼠表達的mRNA進行了定量分析。

2、細胞發(fā)育/分化/增殖/浸潤/凋亡標志基因的表達分析（38篇）

       這部分實驗主要包括調控細胞（含免疫細胞、腫瘤細胞）誘導發(fā)育、分化、增殖、凋亡、浸潤功能有關信號通路（Wnt通路、Notch通路、MAPK通路、p53/p21通路等）關鍵基因、細胞發(fā)育各階段標志基因表達的分析。

       RNA結合蛋白（RNA binding protein，RBP）Lin28家族包括LIN28A和Lin28B兩個成員，具有相似的結構域和功能，可以維持細胞不斷增值、去分化。micorRNA分子let-7在線蟲胚胎不同發(fā)育階段過渡中或在細胞分化過程中起到切換開關的關鍵作用。Lin28可抑制低分化細胞中l(wèi)et-7前體miRNA加工為成熟let-7 miRNA。而Lin 28A/Lin 28B是let-7 miRNA的直接靶點，通過Lin28基因3’-UTR區(qū)抑制lin28的表達。lin28與let-7存在雙負反饋調節(jié)作用。

       內耳耳蝸內的感知機械震動的毛細胞(Hair cell, HC)的丟失是導致人類耳聾的主因。HC和支持細胞(Sertoli Cell, SC)源于一共同的祖細胞池-前感覺細胞。耳蝸前感覺細胞的分化和增殖依賴于Notch、成纖維細胞生長因子受體1(FGFR1)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)和Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的復雜調控。在有絲分裂后期，最終分化為HC的前感覺細胞上調螺旋-環(huán)-螺旋轉錄因子ATOH1，對HC分化至關重要。其余前感覺細胞則由Notch信號介導發(fā)育成SC。Wnt/β-連環(huán)蛋白信號的過度激活或Atoh1表達的異位激活，會刺激新生小鼠/組織中的耳蝸SC重新進入細胞周期并形成新的HC。而抑制Notch信號則可誘導SC轉化為HC。

       約翰斯霍普金斯大學研究團隊實驗表明，祖細胞特異性Lin28B和卵泡抑素(follistatin, FST)的短暫激活，將成熟耳蝸SC重編程為祖細胞樣細胞，使從聽力正常的幼年小鼠中分離出的耳蝸SC具備再生能力，在體外增殖形成新的HC。Lin28B驅動SC重編程的同時，F(xiàn)ST可平衡Lin28B對轉化生長因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β)信號的過度激活。證實Lin28B和FST共激活啟動SCs的HC再生，可能是內源性修復機制的主要調控因子。實驗中，對包括毛細胞（Atoh1、Gfi1、Pou4f3、Scx、Twist1）、毛細胞骨架蛋白MYO7A、Fst、啟動多能性(Hmga2、Trim71)、Lin28家族（Lin28a、Lin28b）、干細胞表面標志Sox2、Notch信號調節(jié)基因Lfng（lunatic fringe）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族（Bmp2、Bmp4）、轉化生長因子β超家族（Inhba、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3）等在內的26個功能性基因的表達進行的檢測，就采用了CFX-Connect和SYBR Green熒光染料標記的方法進行。

3、干細胞發(fā)育分化機制研究（26篇）

       誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS）是指向體細胞中導入特定基因或基因產物，誘導細胞重編程而得到的具有和胚胎干細胞類似的發(fā)育多潛能性的一種細胞類型。iPS具有可持續(xù)增殖能力并可分化成各種細胞，在形態(tài)、基因和蛋白表達、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等與胚胎干細胞極為相似，可分化成人體各組織器官的細胞類型。在疾病模型的建立研究、細胞治療、新藥研究等具有重大潛在應用價值。

        揚州大學研究人員從黑羽狼山雞中分離雞胚成纖維細胞（CEF），轉染Oct4/Sox2/Nanog/Lin28A四種誘導基因后，將CEF重新編程為誘導多能干細胞（iPSCs），這些干細胞通過BMP4 / BMP8b / EGF進一步誘導分化成原始生殖細胞（primordial germ cells， PGC）后，將其移植到白普利茅斯洛克雞胚胎中，產生功能性精子或卵細胞。通過自交產生具有供體特征的189/509體細胞衍生的雞。證明了從體細胞克隆禽類的可行性。對iPS的四個多能性標記基因Oct4、Sox2、Nanog和Lin28A表達情況的分析實驗，用的是CFX Connect實時熒光定量PCR儀。

4、藥效毒理作用和藥效靶點分析（17篇）

       實時熒光定量PCR技術在藥物研究方面的應用主要集中在3個方面。

       一是藥理作用分子機制分析（如藥物作用對靶信號通路中關鍵基因、藥效指示基因及細胞增殖分化關鍵分子表達調控），二是藥物作用靶點分析（如對基質金屬蛋白酶-9），三是其次還被用于疫苗免疫原性評價、中藥提取物的安全性評價。

5、微生物檢測與鑒定（15篇）

       CFX Connect實時熒光定量PCR儀在細菌研究中應用，包括對16SrRNA基因豐度測定評價細菌適應度、細菌代謝功能基因測定、環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)調控、轉基因的檢測等。病毒檢測（如市政廢水中SARS-CoV-2病毒）、真菌檢測也有報道。

6、生物標志物研究（12篇）

       生物標志物一般是指可以標記系統(tǒng)、組織器官、細胞及亞細胞結構或功能改變或可能發(fā)生改變的生化指標，如核酸、蛋白質、酶、糖類以及體內發(fā)現(xiàn)的生物活性分子等，常用于疾病診斷分類，判斷疾病分期、發(fā)展及嚴重程度，評價新藥或新療法的安全性及有效性，以及用于預測個體發(fā)病風險和高危人群臨床篩查等。

       CFX Connect實時熒光定量PCR儀被用于對SARS-CoV-2感染的嚴重程度和預后的預測標志物（白細胞介素-3）、結直腸癌基因表達特征（MSI、BRAF突變和MLH1啟動子甲基化）、食管鱗狀細胞癌放化療療效的預測生物標志物（MMS22L）、巨噬細胞中LPS誘導的炎癥標志物、肺纖維化致病標志物和治療靶點的檢測。

7、藥代動力學基因多態(tài)性和耐藥基因檢測（7篇）

       一般認為，藥物體內代謝、轉運及作用靶點基因的遺傳變異和表達水平變化，會影響藥物的體內濃度和藥物反應的個體差異。藥物基因檢測結果可用于指導臨床個體化用藥、評估嚴重不良反應發(fā)生風險和指導新藥研發(fā)和評價。

       CFX Connect實時熒光定量PCR儀被報道用于真菌、細菌、腫瘤治療藥物的耐藥基因檢測以及藥代動力學相關基因的多態(tài)性的研究中。

(待續(xù))