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如何用MIQE標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的流程與驗(yàn)證設(shè)計(jì)?-上
應(yīng)用驅(qū)動(dòng)型qPCR儀選型攻略-8
普通PCR實(shí)驗(yàn)是每個(gè)反應(yīng)孔中用一組特異性引物對(duì)一種靶基因片段的擴(kuò)增，為單靶標(biāo)或單重PCR反應(yīng)（singleplex PCR/uniplex PCR/Monoplex PCR）。多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction/Multiplex PCR，mPCR）是指每個(gè) PCR 反應(yīng)孔中混合使用兩組或多組不同引物，在單一PCR反應(yīng)中同時(shí)對(duì)多個(gè)DNA模板（Multiple Template PCR Reaction）或同一長(zhǎng)DNA序列模板的不同區(qū)域（Single Template PCR Reaction）擴(kuò)增的PCR反應(yīng)。1988年，美國(guó)分子遺傳學(xué)家首創(chuàng)多重PCR方法，應(yīng)用于產(chǎn)前、產(chǎn)后的杜氏肌肉營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD）篩查診斷，在一個(gè)反應(yīng)孔中用6組引物對(duì)抗肌萎縮蛋白基因的6個(gè)易缺失外顯子片段進(jìn)行擴(kuò)增。
將多重PCR技術(shù)作為內(nèi)核，與凝膠電泳或毛細(xì)管電泳分析結(jié)合，構(gòu)成完整多重PCR分析（Multiplex PCR Assay）流程，可用于感染性疾病的篩查與鑒別診斷、遺傳疾病診斷、細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)、物種鑒定分型、基因克隆篩選、基因突變與缺失檢測(cè)、基因分型、基因修復(fù)和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制等研究。
把多重PCR反應(yīng)作為基礎(chǔ)步驟，整合進(jìn)NGS測(cè)序、染色體免疫共沉淀多重PCR分析（ChIP-mPCR）、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)、滾環(huán)DNA擴(kuò)增技術(shù)( rolling circle DNA amplification, RCA) 、SNP panel identification assay (SPIA)，多重串聯(lián)PCR（Multiplex Tandem PCR/MT-PCR)、多重PCR /液相色譜聯(lián)用分析法(multiplex PCR/liquid chromatography assay，MP/LC)等檢測(cè)流程，早已在基因文庫(kù)制備、多位點(diǎn)STR、SNP基因突變分析等研究中得到應(yīng)用。
而多重PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相結(jié)合，使多重實(shí)時(shí)熒光PCR分析技術(shù)（multiplex real-time PCR assay）破繭而出。
一、多重實(shí)時(shí)熒光PCR與多重PCR概念不同
PubMed檢索數(shù)據(jù)顯示，2016.01-2021-11期間，標(biāo)題中含multiplex PCR的實(shí)驗(yàn)文章共311篇，包括Nat Protocol（IF13.491，1篇）、Acta Pharm Sin B（IF11.413，1篇）、Crit Care（IF9.094，3篇）、Clin Microbiol Infect（IF19.074，2篇）、EBioMedicine（IF8.143，1篇）、Microbiol Spectr（IF7.172，2篇）。僅4篇文章標(biāo)題用multiplex PCR但實(shí)際用的是實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法（Biofire FilmArray Multiplex PCR、Anyplex II RV16、Multicolor melting curve analysis和Color-coded molecular beacons）法。
以multiplex PCR[Body - Key Terms] AND "Nucleic Acids Res"[Journal]檢索獲得多重PCR實(shí)驗(yàn)文章共61篇。其中6篇用的是多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析法，在“材料和方法”中標(biāo)明為quantitative reverse transcriptase multiplex PCR、quantitative multiplex PCR、Real-time multiplex assays、Multiplex quantitative PCR、Quantitative real-time multiplex fluorogenic PCR及multiplex real-time PCR。僅1篇文中使用“For multiplex PCR 200 nM of each primer (HT17, NR24 and BAT26) was added”表述，而附表1: “List of primers used”顯示，實(shí)驗(yàn)是FAM熒光標(biāo)記引物加溶解曲線分析的實(shí)時(shí)熒光PCR方法。
這表明，超過98%的研究人員對(duì)multiplex PCR和multiplex real-time PCR在概念上是有嚴(yán)格區(qū)別的。多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析法用的是quantitative multiplex PCR、multiplex real-time PCR assay類似表述，而非常規(guī)多重PCR的multiplex PCR assay或mPCR。
二、多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)
在多重PCR中，通過在反應(yīng)中包含一對(duì)以上的引物，可以擴(kuò)增出多個(gè)目標(biāo)序列。多重PCR有潛力在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)節(jié)省大量的時(shí)間和精力，而不影響檢測(cè)效用。多重實(shí)時(shí)熒光PCR分析融合了多重PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR兩種技術(shù)方法的天然優(yōu)勢(shì)發(fā)展起來的，具有快速高效、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)。
1. 內(nèi)部參照（Internal Control，IC）優(yōu)勢(shì)
常規(guī)單重實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中設(shè)有單獨(dú)的內(nèi)參反應(yīng)孔，一是檢驗(yàn)擴(kuò)增條件的可行性（評(píng)估PCR擴(kuò)增條件和實(shí)驗(yàn)設(shè)置有效性、擴(kuò)增效率、PCR反應(yīng)抑制程度和PCR反應(yīng)假陰性鑒別等），二是用于對(duì)各樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)的歸一化（消除不同反應(yīng)孔初始樣本量、樣品準(zhǔn)備過程差異對(duì)結(jié)果的影響）。
在多重實(shí)時(shí)熒光PCR分析中，多個(gè)模板是在同一個(gè)反應(yīng)孔中、在相同條件下平行擴(kuò)增，每個(gè)擴(kuò)增子為其他擴(kuò)增子提供了一個(gè)內(nèi)部對(duì)照，便于鑒別潛在的PCR反應(yīng)失敗引起的假陰性問題。
在基因缺失的多重PCR檢測(cè)中，多個(gè)外顯子被擴(kuò)增。除非被掃描的整個(gè)區(qū)域缺失，否則只要有部分片段的得以成功擴(kuò)增，就足以表明擴(kuò)增反應(yīng)沒有問題。所檢測(cè)到的DNA片段缺失是真實(shí)的遺傳性缺失而非檢測(cè)技術(shù)的局限、錯(cuò)誤等導(dǎo)致的假缺失。
2. 高效率低耗費(fèi)優(yōu)勢(shì)
用相同樣品、相同反應(yīng)體積時(shí)，單一模板的多重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，只需提取一次核酸。一個(gè)反應(yīng)孔相當(dāng)于完成了常規(guī)單重PCR數(shù)孔的檢測(cè)任務(wù)，樣品與試劑消耗、PCR體系構(gòu)建準(zhǔn)備工作量與時(shí)間投入都顯著減少。
當(dāng)臨床樣本難以收集或所獲的樣品體積受限（如中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病采集的脊髓液、孕婦羊水標(biāo)本等），或當(dāng)多個(gè)可導(dǎo)致同一臨床表現(xiàn)的不同病原體感染疾病的篩查，單次采樣檢測(cè)多個(gè)致病靶點(diǎn)，可在短短2-3小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)疾病快速、精準(zhǔn)診斷，有利于及時(shí)啟動(dòng)針對(duì)性治療和傳染性疾病的防控措施。
雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)是在同一反應(yīng)孔同時(shí)擴(kuò)增靶序列和內(nèi)參，較常規(guī)兩種序列分開在兩個(gè)單獨(dú)孔中進(jìn)行單重反應(yīng)，反應(yīng)板樣品通量提高2倍。同時(shí)，每個(gè)反應(yīng)孔都減少一半樣本和試劑用量。若將兩個(gè)檢測(cè)靶標(biāo)與一個(gè)內(nèi)參組合進(jìn)行三重實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)，則樣本用量和試劑用量將進(jìn)一步降低。
3. 反應(yīng)模板質(zhì)量的可靠指示能力（Indication of Template Quality）
PCR反應(yīng)的理論效率為100%，表示在指數(shù)擴(kuò)增階段每次熱循環(huán)后的擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量翻倍。但擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度、GC含量、反應(yīng)中各組分的濃度以及聚合酶品質(zhì)等諸多因素影響，導(dǎo)致實(shí)際PCR反應(yīng)效率低于 90%。
因生物樣品本身就可能含有抑制逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)的多種成分，如動(dòng)物肌肉中的肌紅蛋白、尿素，植物組織中的多糖多酚等。多種常用的核酸提取純化試劑，如苯酚、氯仿、SDS等能抑制Taq酶的活性。抑制劑殘留過多的低純度反應(yīng)模板，會(huì)抑制PCR反應(yīng)，使得擴(kuò)增效率超過 110%。通常，抑制劑在高濃度模板中的濃度高，PCR抑制作用強(qiáng)；模板稀釋后抑制劑濃度下降，抑制作用隨之減弱。
因此，當(dāng)擴(kuò)增效率＞110%或＜90%，說明PCR效率存在異常。
此外，反應(yīng)模板如有降解，則引物無法有效退火步驟穩(wěn)定與目標(biāo)區(qū)域結(jié)合，也會(huì)造成擴(kuò)增效率下降。因此，高品質(zhì)的反應(yīng)模板是確保實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)效率、檢測(cè)靈敏度、定量準(zhǔn)確性和定量檢測(cè)線性范圍的基本要求。
多重PCR反應(yīng)比單重PCR反應(yīng)能更有效地反映模板質(zhì)量。
在多重反應(yīng)中，模板發(fā)生降解后，會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)片段的擴(kuò)增信號(hào)比較短目標(biāo)序列信號(hào)弱的征象。此外，PCR抑制劑導(dǎo)致的擴(kuò)增效率降低通過高豐度對(duì)照序列擴(kuò)增損失和參考標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)中豐度極低靶序列的擴(kuò)增效果予以判別。
4. 模板定量的精度優(yōu)勢(shì)
多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)須將檢測(cè)目標(biāo)序列擴(kuò)增數(shù)據(jù)用內(nèi)參對(duì)照測(cè)試值做歸一化處理和分析。
PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)備過程中移液精度波動(dòng)、儀器熱循環(huán)模塊反應(yīng)孔間溫度均一性和模塊溫控精度誤差等客觀因素制約，即便同一個(gè)樣品分散在多個(gè)不同反應(yīng)孔中進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增時(shí)，triplicate或quadruplicate技術(shù)重復(fù)的孔間檢測(cè)數(shù)據(jù)往往也不一致。同理，將待測(cè)靶點(diǎn)與內(nèi)參分開各自獨(dú)立擴(kuò)增取得的初始數(shù)據(jù)歸一化結(jié)果，與二者合并執(zhí)行多重PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，存在差異是毋庸置疑。而且數(shù)據(jù)差異程度會(huì)因操作誤差和儀器溫控性能區(qū)別而異。
目標(biāo)序列和內(nèi)參合并執(zhí)行多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)顯而易見。由于同一反應(yīng)孔中的靶點(diǎn)和內(nèi)參數(shù)據(jù)源于一次加樣，PCR體系構(gòu)建中加樣操作誤差對(duì)靶標(biāo)和內(nèi)參的影響均衡化。用同一反應(yīng)孔的內(nèi)參對(duì)靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化所得數(shù)據(jù)，比利用單重PCR反應(yīng)獲得的結(jié)果，誤差小，精度理應(yīng)更高。
對(duì)于高精度定量實(shí)驗(yàn)，如拷貝數(shù)變異（copy number variation ,CNV）分析實(shí)驗(yàn)，模板拷貝數(shù)具有2倍差異時(shí)，7300、7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)精度就夠。但區(qū)分1.5倍的拷貝數(shù)差異，就需用QuatiStudio 3、QuatiStudio 5、QuatiStudio 6 pro和ViiA7這類有更高分辨精度的熒光定量平臺(tái)。而多重實(shí)時(shí)定量PCR分析更有利于達(dá)到所這類實(shí)驗(yàn)所需的辨別精度。
多重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)以來，在基因缺失分析、突變和多態(tài)性分析、表達(dá)分析和RNA檢測(cè)等應(yīng)用方興未艾。上至Nature、Lancet、Mol Cancer、Neuron、Nucleic Acids Res、Nat Commun、Eur J Hum Genet、J Exp Med、PANS，下至J Clin Microbiol、PLoS One、Am J Pathol、J Mol Diagn等，刊發(fā)的Multiplex Quantitative Real-Time PCR assays實(shí)驗(yàn)論文浩如煙海。
表1 multiplex real-time PCR assay應(yīng)用實(shí)例舉隅
Multiplex type | Material and methods | Source |
Duplex real-time PCR assay | Duplex qPCR orf1a Probe: 5’- FAM / 3’- BHQ1; internal control GAPDH Probe: 5’- VIC / 3’- BHQ1.(Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System) | Roujian Lu, et al. Lancet. 2020 395(10224): 565–574. |
TaqMan gene expression assays: Efnb2 and Sox17 gene probe: 5’- FAM; endogenous control β-actin probe: 5’-VIC. (ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System) | Anjali P. Kusumbe, et al. Nature. 2016; 532(7599): 380–384. | |
multiplexed RT-qPCR reaction Taqman probe: 5’- FAM; endogenous control huGAPDH probe: 5’- VIC; (ABI 7500 Fast Real-time PCR System) | Thomas J Owen, et al. Mol Cancer. 2010; 9: 241 | |
inventoried TaqMan assays Atp5b probe: 5’- FAM / 3’- MBG; Pgc1α probe: 5’- FAM / 3’- MBG; Sirt3 probe: 5’- FAM / 3’- MBG; endogenous control α-actin probe: 5’- VIC / 3’- MGB. (Viia7 Real-Time PCR System) | Luca Perico, et al. Nat Commun. 2017; 8: 983. | |
qPCR screening assay (Genotyping) hydrolysis probe:5’- LightCycler Red 610 ; FRET probe: 5’- LightCycler Red 640 / FRET donor. (Roche LightCycler480II Real-Time PCR System) | Tobias Fleige, et al. Eur J Hum Genet. 2020; 28(2): 193–201. | |
triplex real-time PCR assay | Three specific probe sets: E2B Iva2 probe: 5’- FAM / 3’- TAMRA; Ad5 E1a probe: 5’- NED / 3’- MGBNFQ; Genomic HdAd probe: 5’- VIC / 3’- MGBNFQ. (CFX96 Real-Time Detection System) | Matthias Lübbert, etal. Neuron. 2019; 101(2): 260–273.e6. |
MT-ND4 Probe: 5’- FAM / 3’- MGB; MT-ND1 Probe: 5’- VIC / 3’- MGB; D-Loop Probe: 5’- NED / 3’- MGB. (StepOnePlus Real-Time PCR System) | Karolina A. Rygiel, et al. Nucleic Acids Res. 2016; 44(11): 5313–5329. | |
Triplex RT-qPCR assay: dengue virus probe: 5’- FAM / 3’- BHQ-1; chikungunya virus probe: 5’- HEX / 3’- BHQ-1; Zika virus probe: 5’- Cal fluor red 610 / 3’- BHQ-2. (ABI 7500 Fast Dx Real-Time PCR System) | Gilberto A. Santiago, et al. Nat Commun. 2018; 9: 1391. | |
quadplex real-time PCR assay | internal hydrolysis probe: Gag probe: 5’- FAM- ZEN / 3’- IABkFQ; Env probe: 5’- VIC / 3’- MGB; Pol probe: 5’- NED / 3’- MGB; PS probe: 5’- Cy5 / 3’- IAbRQSp. (QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System) | Christian Gaebler, et al. J Exp Med. 2019; 216(10): 2253–2264. |
quadruplex real-time PCR assay D. longicolla probe: 5’- FAM / 3’- BMN-Q535; D. novem probe: 5’- HEX / 3’- BMN-Q535; D. eres probe: 5’- ROX / 3’- BMN-Q590; D. caulivora probe: 5’- Cy5 / 3’- BMN-Q620. (CFX96 Real-Time Detection System) | Behnoush Hosseini, et al. PLoS One. 2021; 16(9): e0257225 | |
Five targets real-time PCR assay | qRT-PCR Multiplex assays probe: 5’- FAM / 3’- BHQ1; probe: 5’- CAL Fluor Gold 540 / 3’- BHQ1; probe: 5’- CAL Fluor Red 610 / 3’- BHQ2; probe: 5’- Quasar 670 / 3’- BHQ2; probe: 5’- Quasar 705 / 3’- BHQ2. (CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System) | Adam J. Northcutt, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019; 116(52): 26980–26990. |
molecular beacon probes Multiplex assays MB147G probe: 5’- FAM / 3’- DABCYL MB308C probe: 5’- HEX / 3’- DABCYL MB814C probe: 5’- CAL Fluor Red 610 / 3’- BHQ-2 MB308T、MB716C probe: 5’- Quasar 670 / 3’- BHQ-2 MB716T probe: 5’- Atto 425 / 3’- DABCYL (Agilent Stratagene Mx3005P qPCR system) | Liang Chen, et al. J Clin Microbiol. 2011; 49(2): 579–585. |
（未完待續(xù)）
