Invitrogen iBright FL1500, 是美國賽默飛公司2019年上市的一款主要針對Western Blot免疫印跡多色熒光檢測應(yīng)用而推出的多功能成像分析系統(tǒng)。它隨機標(biāo)準(zhǔn)配置包括l藍綠色LED透射儀、SDS-PAGE染色凝膠白光屏（White trans-illuminator screen）、熒光濾光片套件、印跡參考樣品（iBright Imaging System Sample Blot / Reference target）、安全防護眼鏡（Safe Imager Viewing Glasses）和PC端iBright Image Analysis Software。既支持熒光印跡（一張印跡膜上可同時檢測綠色、橙色、紅色、遠紅外和近紅外5種熒光）、HRP和AP底物的化學(xué)發(fā)光印跡和顯色法（如Ponceau S、MemCode染色）蛋白印跡成像檢測，還可用于熒光染色、顯色和染色的核酸、蛋白質(zhì)凝膠的成像分析。

       在Western Blot多功能成像分析領(lǐng)域， Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System (1708280，2013)/ChemiDoc MP Imaging System (12003154，2020)、GE Amersham Imager 600 RGB（AI600, 2014）/ ImageQuant 800 Fluor（AI800, 2019）、UVP ChemStudio Plus Imaging Systems（2013）等老牌強手環(huán)伺左右，此時Invitrogen iBright FL1500的入場，略顯得姍姍來遲。  

       據(jù)阿拉斯加科技2022年10月完成的一項調(diào)查顯示：從2013年11月-2022年10月，以“ChemiDoc MP[Text Word]”為檢索條件在PubMed期刊數(shù)據(jù)庫共查到52篇article。而以“iBright [Text Word] AND FL1500 [Text Word]”作關(guān)鍵詞檢索，共獲得152條記錄。

       業(yè)界流行“后發(fā)優(yōu)勢”一說。那iBright FL1500在吸收了“前輩”的技術(shù)精華后，到底煉就何等吸“睛”大法，逆襲躋身強林的？為此，我們推出《撥開云霧見月明——英捷iBright FL1500 Western熒光成像分析儀技術(shù)特點解析》系列文案，從硬件配置到軟件模塊4個角度，對iBright FL1500進行剖析，以期我們對該產(chǎn)品為代表的Western熒光成像分析儀、連帶Western ECL成像系統(tǒng)有更深入的了解。

一、多功能熒光檢測應(yīng)用

       對上述使用iBright FL1500 Western熒光成像儀實施檢測的152個應(yīng)用實例，按檢測樣品類型分類統(tǒng)計結(jié)果顯示：

表1  iBright FL1500 Western熒光成像儀檢測應(yīng)用舉隅

        表1信息表明，iBright FL1500 Western熒光成像儀應(yīng)用實例中，80%屬于化學(xué)發(fā)光Blot檢測（enhanced chemiluminescence Blot，ECL）；熒光測定類應(yīng)用的占比不足20%，主要包括蛋白Blot、熒光標(biāo)記蛋白凝膠、熒光標(biāo)記核酸凝膠和微生物克隆板熒光檢測。20%的比例雖不算高，但足以證明樣品熒光類應(yīng)用不可或缺。

       凝膠成像分析儀（如Bio-Rad GelDoc Go、Axygen GDBL-1000）和多數(shù)印跡化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（如Bio-Rad ChemiDoc、ChemiScope 6100BZ和ChemiScope 6200），標(biāo)配通常是302nm波長紫外透射光源，無法激發(fā)Cy5（Ex 649nm，Em 670nm）、Cy3（Ex 552nm，Em 570nm）、SYPRO Orange（Ex 470nm，Em 570nm）等凝膠熒光染料，或激發(fā)SYBR Green（Ex 498nm，Em 522nm）、SYBR Gold（Ex 490nm，Em 540nm）、Gel Green（Ex 500nm，Em 530nm）難以達到最佳分析效果。最關(guān)鍵的是，Western ECL成像儀缺少特異性熒光濾光組件，而凝膠成像儀則熒光濾鏡、冷CCD都缺失，因此，都無法勝任微弱熒光信號的采集。

       因此，既配置有透射紫外（Trans-UV）和(或)透射藍光（Trans-blue）激發(fā)光源，又擁有多組特異性熒光激發(fā)-發(fā)射濾光組件和冷CCD的Western熒光成像分析儀，自然成為SYPRO Orange、SYBR Gold等熒光染料標(biāo)記凝膠樣品檢測的理想方案。

表2 主流品牌Western多功能成像分析系統(tǒng)熒光檢測模塊配置表

        Western熒光成像分析儀，顧名思義，是可用于單重（singleplex）或多重（multiplex）熒光標(biāo)記印跡的圖像采集與分析。熒光印跡檢測技術(shù)（fluorescent Blot）比ECL印跡分析法究竟有何技術(shù)優(yōu)勢？我們認為，熒光蛋白印跡檢測的優(yōu)勢主要是“三高”，即高特異性、高效率和高分辨力。

1、熒光Blot檢測的高特異性

       幾乎所有原核和真核細胞樣品，在熒光檢測過程中都不同程度地存在與檢測信號無關(guān)的自發(fā)熒光。樣品內(nèi)源成份（如組織細胞結(jié)構(gòu)組成成分和代謝物）、樣品處理中引入的外源物質(zhì)（如組織固定所用的多聚甲醛等）和樣品所用器材（如試劑和轉(zhuǎn)印膜），都可能助長這種背景熒光信號。其中一些組分無需激發(fā)光誘導(dǎo)即可產(chǎn)生自發(fā)熒光，如作為細胞外基質(zhì)主要成分的膠原蛋白（Em 350-450 nm），細胞內(nèi)核黃素（Em 550 nm），動物及細菌樣品中的維生素A（Em 500 nm）等。
        紅藍綠色自發(fā)熒光的存在，連同電泳、轉(zhuǎn)印過程的誤差，往往使ECL法印跡圖像背景增強，Blot條帶-背景反差削弱，檢測信噪比(S/B)降低。當(dāng)然，自發(fā)熒光與測試熒光基團的光譜如存在重疊，則背景熒光同樣會干擾樣品熒光Blot分析，降低測試靈敏度和準(zhǔn)確性。

       熒光印跡分析依托熒光濾光片組件和低溫冷CCD檢測器進行。帶寬優(yōu)化光學(xué)濾片，可將激發(fā)光源、樣品和印跡膜自發(fā)熒光等高效濾除，只允許波長特異性熒光信號進入CCD，Blot圖像中背景信號被極大削弱。

(上圖：通過多個熒光通道獲取的熒光圖像及疊加后效果；下圖：用iBright FL1500采集的ECL Blot條帶成像后再手工合并圖像)

       對比熒光Blot和用于發(fā)表的ECL印跡（原圖經(jīng)反相轉(zhuǎn)換成經(jīng)典放射性自顯影底片的效果）圖像，不管是添加偽彩色的多色熒光疊加圖還是單色熒光圖，熒光Blot圖像都顯得更背景更“干凈”，條帶與背景對比反差更大。一張圖上可呈現(xiàn)所有檢測對象。
       圖像的基礎(chǔ)背景低，條帶定量分析時，條帶信號經(jīng)背景扣除處理后所保留的有效值更高，對弱信號條帶檢測分辨力的提高極為有利。

2、熒光Blot檢測的高分辨力

       蛋白質(zhì)磷酸化修飾和去磷酸化，是調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達及細胞的增殖分化等生理病理過程啟動的一個重要分子開關(guān)。通過檢測蛋白質(zhì)磷酸化，了解特定蛋白質(zhì)在細胞受到多種生物和非生物脅迫刺激時的磷酸化水平變化情況，有助于理解蛋白質(zhì)在其中所發(fā)揮的調(diào)控功能和內(nèi)在機制。

       Western Blot 與ELISA、激酶活性分析及質(zhì)譜，都是檢測蛋白磷酸化狀態(tài)的常用方法。蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到膜上，采用磷酸化特異的抗體可精確識別蛋白磷酸化氨基酸位點，實現(xiàn)對蛋白磷酸化水平的定性、定量分析。

       因磷酸化修飾所引起蛋白分子量變化非常微小，磷酸化及非磷酸化兩種不同狀態(tài)的蛋白，經(jīng)凝膠分離后的條帶往往緊貼、重疊，這給ECL化學(xué)發(fā)光標(biāo)記法區(qū)分這兩種蛋白組分帶來難以克服的困難。而此時，Western多色熒光檢測技術(shù)則正好可以大顯身手。

      如圖所示，原本空間位置相互重疊的MAPK信號通路ERK家族成員，ERK1/2(p44/42)總蛋白和發(fā)生磷酸化修飾的ERK1/2（Phospho-p44/42），分別經(jīng)自特異性一抗錨定，再采用DyLight 800、StarBright B700兩種不同的熒光基團標(biāo)記的二抗檢測，借助于兩個熒光通道，分別采集到出紅色（磷酸化修飾的ERK1/2）、綠色（ERK1/2總蛋白）兩種信號。兩個通道的圖像經(jīng)疊加可見，在圖像同一個位置，同時呈現(xiàn)出紅色、綠色和紅綠復(fù)合形成的黃色信號窄帶。疊加圖上紅、綠兩種信號的條帶邊界重疊難以分辨，但在不同熒光通道內(nèi)，各條帶邊界則清晰分明，為分析各條帶提供了極大便利。

      而目前已知的蛋白翻譯后修飾方式多達20種以上，除磷酸化，乙?；?、泛素化、甲基化也都屬常見蛋白修飾方式并參與機體多樣化生命過程調(diào)控。使用多重?zé)晒庥≯E檢測技術(shù)，研究人員用3-4個熒光基團標(biāo)記多種蛋白質(zhì)，每種蛋白質(zhì)的檢測信號在不同熒光通道中采集，從而達到在同一印跡上一次檢測多種蛋白質(zhì)（不受蛋白間的分子量大小的影響），可區(qū)分在復(fù)雜生物學(xué)調(diào)控路徑中各蛋白的角色定位。操作過程無須裁膜、無須逐一剝離蛋白組分，簡便高效。

3、熒光Blot檢測的高效性

      Western熒光成像分析系統(tǒng)所配置的熒光檢測通路，決定了印跡可同時分析的目標(biāo)蛋白的種數(shù)和印跡檢測所適用二抗熒光基團的光譜屬性。

      表2信息顯示，主流品牌型號的熒光通道配置數(shù)量、濾光片光譜截止范圍雖有一定差異，但可發(fā)現(xiàn)以下共同點：

      1）綠色熒光通路（Em525/BP20nm）：適用于SYBR Gold、SYBR Green、GelSafe等；
      2）橙黃色熒光通路（Em605/BP40nm）：適用于Cy3/SYPRO Orange/Alexa Fluor 546/EB等；
      3）紅色熒光通路（Em705/BP40nm）：適用于CY5/Alexa Fluor 647等；
      4）遠紅外(FIR)熒光通路（Em715/BP30nm）：適用于IRDye 680/Alexa Fluor 680等；
      5）近紅外(NIR)熒光通路（Em836/BP40nm）：適用于IRDye800/Alexa Fluor 790等。

      目前主流Western熒光成像分析儀的熒光檢測通路配置數(shù)量普遍高于2012-2013年版機型。譬如，2012版ChemiDoc MP Imaging System為3熒光通道（6位濾光片輪，預(yù)留1個空位用于化學(xué)發(fā)光檢測，1個標(biāo)準(zhǔn)顯色/白光濾片，外加綠530nm、紅605nm、深紅695nm三組熒光濾片）。2013版Amersham Imager 600 RGB設(shè)置的也是綠Cy2 (525BP20nm)、紅Cy3/EB (605BP40nm)、深紅Cy5 (705BP40nm) 三個通道。而2019版上市的ChemiDoc MP、Amersham ImageQuant 800（AI 800）和iBright FL1500，均采用了8位濾光片輪，熒光通道數(shù)量擴充至5個。

      熒光檢測通道數(shù)量和適用光譜種類的增加，帶來至少2方面的便利。

      首先，由于樣品自發(fā)熒光多集中在藍色、綠色和紅色的可見光（波長380-700nm）范圍，新增的遠紅外、近紅外外熒光檢測通道，基本避開電泳樣品中其它生物分子和轉(zhuǎn)印膜自發(fā)熒光的背景干擾，使獲得更高圖像信噪比成為可能。

      其次，熒光通道增加，使得多通道熒光應(yīng)用的組合更靈活。

      以iBright FL1500為例，熒光發(fā)射端共設(shè)置了Em1：508-537nm(Alexa Fluor 488) 、Em2：568-617nm(Alexa Fluor 546) 、Em3：675-720nm(Alexa Fluor 647) 、Em4：710-730mn(Alexa Fluor 680) 和Em5：800-850nm(Alexa Fluor 790)共5個通道。

      預(yù)留一個通道用于內(nèi)參蛋白信號檢測，再從檢測光譜存在明顯重疊的Em3 (675-720nm)和Em4 (710-730mn)中2選1后，iBright FL1500可以同時對采用Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 647和Alexa Fluor Plus 800標(biāo)記四種蛋白同時檢測。

      Em3、Em4兩個通道的檢測光譜存在一定程度的重疊，而熒光染料存在主、次激發(fā)峰。當(dāng)中一個通道測試時，另一種染料的次激發(fā)效應(yīng)信號也同時被主檢測通道捕獲。這樣使數(shù)據(jù)分析的邏輯出現(xiàn)混亂：原已被分離的兩個蛋白，竟都包含有另一種蛋白信號。而事實上純屬光學(xué)通道間信號竄擾（cross-talk）所致。因此，兩個存在光譜重疊的檢測通道，在一次測試中只能用其中一個以杜絕信號竄擾現(xiàn)象。這樣一來，Western Blot成像分析儀雖配置有5個通道，實際卻只能同時使用4個通道。此現(xiàn)象不僅存在于iBright FL1500系統(tǒng)，同樣也能在新版ChemiDoc MP和ImageQuant 800 Fluor上觀察到。

      還須注意的是，就Western印跡多色熒光分析實驗而言，5通道配置系統(tǒng)實際可同時檢測的蛋白最多只能達到3種（如內(nèi)參β-actin+pAKT+AKT三種熒光同時檢測模式）。這是因為嚴(yán)格的Western Blot實驗還需要進行TPN處理，而總蛋白的測定通常需占用一個檢測通道。