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赤橙黃綠青藍(lán)紫 誰(shuí)持彩練當(dāng)空舞——激酶活性HTRF檢測(cè)的熒光酶標(biāo)儀方案-下
基于應(yīng)用的多功能熒光酶標(biāo)儀選型-3
（續(xù)：激酶活性HTRF檢測(cè)的熒光酶標(biāo)儀解決方案-中）
三、HTRF檢測(cè)應(yīng)用中多功能熒光酶標(biāo)儀的選型要略
常規(guī)FI、TRF、FRET檢測(cè)，人們可能只關(guān)注到熒光酶標(biāo)儀的激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)配置與測(cè)試要求契合的問題。而當(dāng)了解HTRF標(biāo)準(zhǔn)流程后，對(duì)優(yōu)化熒光檢測(cè)條件的意義和其中涉及的技術(shù)要素之復(fù)雜，興許會(huì)有感悟。
開展HTRF測(cè)試前，實(shí)驗(yàn)者首先須確認(rèn)是否有可利用的HTRF認(rèn)證多功能熒光酶標(biāo)儀資源。
表2 Cisbio HTRF認(rèn)證部分品牌多功能熒光酶標(biāo)儀列表
Manufacturer | BMG | PerkinElmer | MD | BioTek | Tecan |
可供型號(hào) | VantaStar FluoStar Omega PolarStar Omega ClarioStar Plus PheraStar FSX | EnVision XCite EnVision HTS | SpectraMax iD5 SpectraMax Paradigm SpectraMax i3x SpectraMax M5e Flexstation 3 | Synergy H1 Synergy NEO2 Cytation 1 Cytation 5 | Infinite F Nano+ Infinite F Plex Spark |
停產(chǎn)型號(hào) | Clariostar Pherastar Plus Pherastar FS | / | SpectraMax i3 | Cytation 3 Synergy 4 Synergy H4 Synergy NEO Synergy 2 | Infinite F200 PRO Infinite F500 Infinite M1000 Infinite M1000 PRO Safire 2 |
(資料來(lái)源：PerkinElmer&Cisbio官網(wǎng)信息，入選時(shí)有刪減)
確認(rèn)多功能熒光酶標(biāo)儀屬HTRF認(rèn)證型號(hào)后，還應(yīng)核實(shí)是否配置有HRTF檢測(cè)規(guī)定的專用光學(xué)元件。不同品牌機(jī)型，制造商提供的HTRF功能組件有區(qū)別。
如VantaStar、Folarstar Omega、SpectraMax iD5、Synergy NEO2均須添加HTRF專用的具有Z軸調(diào)節(jié)功能的增強(qiáng)型時(shí)間分辨熒光模塊（Enhanced TRF module）、320/340nm紫外激發(fā)濾片、520/620/665nm發(fā)射熒光濾鏡這三件套。
相對(duì)而言，MD SpectraMax i3、SpectraMax Paradigm、SpectraMax i3x這三款熒光酶標(biāo)儀，由于采用的是檢測(cè)功能模塊化設(shè)計(jì)，必要時(shí)直接將選配的HTRF檢測(cè)卡盒插入主機(jī)卡槽就可以啟動(dòng)測(cè)試。實(shí)驗(yàn)者無(wú)須為激發(fā)與發(fā)射濾光片的波長(zhǎng)與帶寬、二向分色鏡截止波長(zhǎng)范圍這類問題糾結(jié)。
為方便查詢，表3列出了部分品牌制造商的HTRF認(rèn)證機(jī)型系統(tǒng)配置，可供參考。
表3 品牌多功能熒光酶標(biāo)儀HTRF檢測(cè)所需配置
Brand | Instrument Model | HTRF Configurations |
MD | SpectraMax iD5 | HTRF Detection System (6590-0144), includes: Enhanced TRF module (0200-7030) Filter slides EX: 340nm BW 70nm (6590-0080) EM2: 520nm BW 15nm (6590-0098) EM1: 616nm BW 10nm (6590-0118) EM2: 665nm BW 10nm (6590-0121) |
SpectraMax Paradigm | Cisbio HTRF detection (0200-7011) , includes: Xenon light source 616nm EM1 filter 665nm EM2 filter | |
SpectraMax i3X | ||
BioTek | Synergy H1/H4 | HTRF europium/Red filter cubes (8040505): EX 330/80nm; EM1 620/10nm, EM2 665/8nm; Dichroic 365nm |
Synergy Cytation 1/3/5 | ||
Synergy NEO2 | 1) HTRF Europium/Red Kit, includes: HTRF-europium Excitation cubes(1035011): 330/80nm; Dichroic 365nm HTRF/Lance red Emission cubes (dual emission)(1035041): EM1 620/10nm, EM2 665/8nm; Dichroic 650nm 2) HTRF Europium/Green Kit, includes: HTRF terbium Excitation (1035012): 340/30nm; Dichroic 400nm HTRF green Emission cubes (dual emission)(1035049): EM1 520/10nm, EM2 620/10nm; Dichroic 550nm | |
BMG | VantaStar | ?1) HTRF Europium/Red Kit, includes: ?Advanced Optic Head with z-adjustment for TRF/TR-FRET Excitation filter：337nm (TR-Ex H)(001-337TR) Emission filter：620/8.5nm(001-615TR); 665/10nm(001-665TR) 2) HTRF Terbium/Green Kit, includes: Advanced Optic Head with z-adjustment for TRF/TR-FRET ?Excitation filter：337nm (TR-Ex H)(001-337TR) Emission filter：620/8.5nm(001-615TR); 520/10nm(001-520TR) |
Tecan | Infinite F Nano+ | 1) HTRF Europium/Red Kit, includes: ?Excitation filter：320/25nm (8C138) Emission filter：620/10nm;Dichroic 510nm(6F041) 2) HTRF Terbium/Green Kit, includes: ?Excitation filter：320/25nm (8C138) Emission filter：665/8.5nm;Dichroic 510nm(9E336) |
nfinite F Plex | ||
Spark | ||
PE | EnVision XCite (TSM) | 1) HTRF Europium/Red Kit, includes: Excitation filter：UV2(TRF) 320 (#111) Emission filter：APC 665 (#205) 2nd emission filter：CY5 620 (#118) or 615 (#203) Top Mirror：TRF advanced single mirror (#615) or Lance/Delfia D400 single mirror (#412) 2) HTRF Terbium/Green Kit, includes: Excitation filter：TRF UV2 340 (#101) Emission filter：TRF 520(#275) or (#226) 2nd emission filter：495 (#276) for simultaneous readout Top Mirror：TRF advanced single mirror (#615) or Lance/Delfia D400 single mirror (#412) |
EnVision HTS (SDE) | 1) HTRF Europium/Red Kit, includes: Excitation filter：UV2(TRF) 320 (#111) Emission filter：APC 665 (#205) 2nd emission filter：CY5 620 (#118) or 615 (#203) Mirror：TRF Lance D407/D630 advanced dual mirror (#666) or Lance/Delfia D400/D630 dual mirror (#662) 2) HTRF Terbium/Green Kit, includes: Excitation filter：TRF UV2 340 (#101) Emission filter：TRF 520(#275) or (#226) 2nd emission filter：495 (#276) for simultaneous readout Top Mirror：TRF D407/D505 advanced dual mirror(#664) or D400/D505 dual mirror (#657) |
擁有HTRF認(rèn)證資質(zhì)的熒光酶標(biāo)儀、配套光學(xué)元件支持，再加上HTRF檢測(cè)試劑，開展HTRF技術(shù)研究方可謂萬(wàn)事俱備、水到渠成。
四、HTRF檢測(cè)程序與同類TR-FRET方法間的兼容性
目前，同樣是基于TR-FRET技術(shù)開發(fā)的檢測(cè)試劑， HTRF之外還有MD IMAP Assays、BellBrook Transcreener assay 、Invitrogen LanthaScreen TR-FRET Kinase Assay、Bioauxilium Thunder Enhanced TR-FRET assay、PE Lance TR-FRET Assays等。
單論測(cè)試光譜數(shù)據(jù)，這些TR-FRET試劑的檢測(cè)光譜設(shè)置基本是通用的。那實(shí)際工作中，其他同類產(chǎn)品能否用HTRF的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)程序測(cè)定？
分析結(jié)果是：不行。
表4 市面TR-FRET類試劑產(chǎn)品測(cè)試光譜特征
TR-FRET Assay | TRF Cage Type | Excitation | 2nd Emission | FRET Acceptor | 1st Emission |
HTRF-Eu/red assay | Europium cryptate | 320 nm | 620 nm | XL665/d2 | 665 nm |
HTRF-Tb/red assay | Terbium cryptate | 340 nm | 620 nm | XL665/d2 | 665 nm |
HTRF-Tb/green assay | Terbium Cryptate | 340 nm | 620 nm | Fluorescein/GFP | 520 nm |
LanthaScreen TR-FRET assay | Europium Chelate | 320 nm | 620 nm | AlexaFluor 647 | 665 nm |
LanthaScreen TR-FRET assay | Terbium Chelate | 340 nm | 490 nm | Fluorescein/GFP | 520 nm |
Transcreener TR-FRET assay | Terbium Chelate | 340 nm | 620 nm | HiLyte647 | 665 nm |
LANCE assay | Europium Chelate | 320 nm | 620 nm | ULight | 665 nm |
LANCE assay | Europium Chelate | 320 nm | 620 nm | Surelight APC | 665 nm |
THUNDER TR-FRET assay | Europium Chelate | 320 nm | 620 nm | Far-red dye | 665 nm |
PE-Cisbio強(qiáng)調(diào)的是，HTRF認(rèn)證測(cè)試流程、方法的應(yīng)用范圍嚴(yán)格限于HTRF試劑和技術(shù)使用，不適用于用于其他TR-FRET產(chǎn)品的測(cè)定。
TRF-FRET檢測(cè)具有時(shí)間高度靈敏的特性。在各種不同來(lái)源樣品測(cè)試條件下，不同TRF-FRET試劑盒的熒光光譜穩(wěn)定性、半衰期特征的差異，注定了檢測(cè)過程的積分時(shí)間、脈沖數(shù)量、時(shí)間延遲幾個(gè)關(guān)鍵參數(shù)難以完全匹配。盡管兩種試劑盒測(cè)定的激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)峰值特征一致，但不代表TRF-FRET過程中供體、受體兩種熒光信號(hào)的動(dòng)力曲線相同。
HTRF試劑采用有大環(huán)結(jié)構(gòu)的穴狀態(tài)鑭系配合物，其光譜穩(wěn)定性優(yōu)異，與特殊優(yōu)化的緩沖液配合，可以實(shí)現(xiàn)0.6-1ms的超長(zhǎng)熒光壽命。其他的TR-FRET技術(shù)中所用的鑭系配合物、FRET能量受體釋放的FRET熒光信號(hào)動(dòng)力學(xué)特征除非能高度還原HTRF產(chǎn)品FRET過程的熒光表現(xiàn)。否則，在同一型號(hào)熒光酶標(biāo)儀上用HTRF提供的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試程序測(cè)定其他廠商試劑，難免弄巧成拙、東施效顰。
表5 Ciosbio HTRF VS LanthaScreen檢測(cè)參數(shù)設(shè)置對(duì)比
Assays | Ciosbio HTRF-Eu/red Assay | LanthaScreen Eu Kinase Activity Assay |
Excitation filter | 337nm | Ex 340/30 nm |
Emission filter | 620/8.5nm，665/10nm | Em 665/10 nm，Em 620/10 nm; Dichroic LANCE/TRF |
Delay Time | 60 μs | 100 μs |
Integration Time | 400 μs | 200 μs |
對(duì)比Ciosbio HTRF-Eu/red Assay、LanthaScreen Eu Kinase Activity Assay在Perkin Elmer EnVision多功能熒光酶標(biāo)儀上檢測(cè)所用的測(cè)試參數(shù)，可發(fā)現(xiàn)：盡管兩個(gè)試劑盒規(guī)定的激發(fā)波長(zhǎng)、雙熒光發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)置基本一致（測(cè)試年份不同，同一型號(hào)儀器出廠預(yù)裝濾光片規(guī)格略有變動(dòng)），但脈沖信號(hào)的積分時(shí)間延遲（HTRF-60μs VS LanthaScreen-100μs）、積分時(shí)間長(zhǎng)度（HTRF-400μs VS LanthaScreen-200μs）的設(shè)定迥異。
這證實(shí)了我們分析的結(jié)論：不同TR-FRET試劑盒在熒光多功能酶標(biāo)儀上的規(guī)定的測(cè)試條件設(shè)置存在較大區(qū)別，其標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)程序相互難以有效兼容。
表5的信息還表明：與Ciosbio HTRF-Eu比，LanthaScreen Europium激發(fā)的背景熒光衰減慢、而FRET供體和受體的熒光壽命短；LanthaScreen Eu檢測(cè)時(shí)間延遲拉長(zhǎng)，極大地限制了檢測(cè)積分窗口的選擇余地和測(cè)試靈敏度的提升空間。
參考文獻(xiàn)：
［1］G Mathis. Rare earth cryptates and homogeneous fluoroimmunoassays with human sera. Clin Chem. 1993 Sep;39(9):1953-9.
［2］Mathis G. HTRF(R) Technology. J Biomol Screen. 1999;4(6):309–14.
［3］Bazin H, Trinquet E, Mathis G. Time resolved amplification of cryptate emission: a versatile technology to trace biomolecular interactions. J Biotechnol. 2002; 82(3):233–50.
［4］Degorce F, Card A, Soh S, Trinquet E, Knapik GP, Xie B. HTRF: A technology tailored for drug discovery — a review of theoretical aspects and recent applications. Curr Chem Genomics. 2009;3:22–32.
［5］HTRF Europium cryptate donor/Red acceptor readout Setup recommendations for Polarstar Omega (PerkinElmer & Cisbio).
［6］HTRF Europium cryptate donor/Red acceptor readout Setup recommendations for SpectraMax iD5 (PerkinElmer & Cisbio).
［7］HTRF Europium cryptate donor/Red acceptor readout Setup recommendations for Infinite F200 PRO (PerkinElmer & Cisbio).
［8］HTRF Europium cryptate donor/Red acceptor readout Setup recommendations for Envision equipped in Flash lamp (PerkinElmer & Cisbio).
［9］HTRF Europium cryptate donor/Red acceptor readout Setup recommendations for Synergy NEO2 equipped in Flash lamp (PerkinElmer & Cisbio).
［10］SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader User Guide (5059784H,01/2022).
［11］Omega Family of Readers Operating Manual (Rev G).
［12］柳蘇月, 田晶晶, 田洪濤等. 鋱(Ⅲ)離子及其復(fù)合物：從發(fā)光特性到傳感應(yīng)用. 生物技術(shù)通報(bào), 2020, 36(4): 192-207.
［13］Agilent BioTek Detection Accessories Brochure (5994-4172EN).
［14］LanthaScreen TR-FRET Phospho-specific Antibody Reagents and Substrates User Guide (14 April 2009).
［15］EnVision Multi-label Plate Reader Brochure (007309D_01).
［16］Franka Maurer, Thomas Roux, Fanny Plénière, et al. Cellular and biochemical HTRF assays measured in 1536-well microplates.(BMG LABTECH GmbH, Cisbio Bioassays).
