一、Western Blot條帶定量分析引入TPN方法的必要性

      Western Blot實(shí)驗(yàn)操作的多個(gè)步驟都可能存在誤差，如樣品稀釋濃度和上樣移液體積誤差，蛋白轉(zhuǎn)膜效率差異等。為使蛋白印跡條帶間的信號(hào)強(qiáng)度差異，能準(zhǔn)確反映出樣品間的蛋白質(zhì)表達(dá)水平差異，需要對Blot各泳道中條帶的有效信號(hào)強(qiáng)度值進(jìn)行歸一化（Normalization）處理。歸一化處理通常是三步進(jìn)行。首先，對每個(gè)泳道所有蛋白條帶做扣除背景操作獲得各條帶的有效信號(hào)強(qiáng)度值。第二步，從印跡上選擇一個(gè)參考泳道（通常是第一個(gè)樣品泳道，也可以是人為認(rèn)定的其他泳道)，以參考通道的內(nèi)參蛋白信號(hào)強(qiáng)度為基準(zhǔn)，將其與其他泳道的內(nèi)參有效信號(hào)值相除，得出每個(gè)泳道的歸一化因子（normalization factor）。最后，將靶蛋白條帶有效信號(hào)值乘以歸一化因子，得到條帶信號(hào)強(qiáng)度的歸一化數(shù)值，以此歸一化值作為蛋白表達(dá)豐度統(tǒng)計(jì)分析的依據(jù)。

      Western Blot實(shí)驗(yàn)常用內(nèi)參蛋白有兩種。一種是存在于所有樣品中、且其表達(dá)較穩(wěn)定的管家蛋白（Housekeeping protein, HKP）。另一種是印跡中各泳道的總蛋白。無論選誰做內(nèi)參，都需滿足兩個(gè)條件：

      1）內(nèi)參的表達(dá)須不受組織來源、實(shí)驗(yàn)處理方法的影響；

      2）電轉(zhuǎn)印完成后，靶蛋白、內(nèi)參蛋白的信號(hào)強(qiáng)度均應(yīng)處于各自的檢測線性動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)（即檢測信號(hào)強(qiáng)度隨蛋白質(zhì)上樣量增加而成比例增加）。

      不少研究已觀察到：管家蛋白在不同組織來源表達(dá)量不同，經(jīng)不同實(shí)驗(yàn)干預(yù)處理后表達(dá)也不相同。內(nèi)參蛋白通常表達(dá)量較高，但上樣量—條帶信號(hào)強(qiáng)度線性關(guān)系表現(xiàn)不佳。而通常靶蛋白的表達(dá)較低，當(dāng)加大靶蛋白上樣量時(shí)，高表達(dá)的管家蛋白易出現(xiàn)過載，信號(hào)強(qiáng)度超出其定量線性范圍的情形。因此，未經(jīng)驗(yàn)證地將β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、α-微管蛋白(α-tubulin)和次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶1 (HPRT1)等管家蛋白用作Western Blot內(nèi)參，從流程到方法都是錯(cuò)誤的。                                              

      而總蛋白歸一化(Total Protein Normalization, TPN)方法則克服了管家蛋白歸一化方法的諸多缺點(diǎn)。

      TPN是指Blot的單個(gè)泳道內(nèi)所有蛋白條帶的總信號(hào)值扣除背景后的總有效值確定為該泳道內(nèi)蛋白總上樣量、將此信號(hào)值與參考泳道相應(yīng)指標(biāo)來相除結(jié)果作為該泳道所有蛋白條帶信號(hào)強(qiáng)度的歸一化因子的方法。

      所有條帶總蛋白作為內(nèi)參蛋白，不易受實(shí)驗(yàn)處理方法、組織細(xì)胞來源的影響，而最重要的是，大多數(shù)總蛋白的線性動(dòng)態(tài)范圍能與低表達(dá)靶蛋白的線性范圍匹配。研究表明，在 10–50μg常規(guī)上樣量范圍，總蛋白Blot信號(hào)值均表現(xiàn)出良好線性特征，不易出現(xiàn)信號(hào)過飽現(xiàn)象，可真實(shí)地反映該泳道的總蛋白上樣量。因此，TPN方法可用于大多數(shù)蛋白Blot條帶的定量分析。

      目前，部分學(xué)術(shù)期刊要求嚴(yán)格遵守使用內(nèi)參的標(biāo)準(zhǔn)，使用可產(chǎn)生線性動(dòng)態(tài)范圍的成像技術(shù)。而越來越多的研究者在發(fā)文中Western實(shí)驗(yàn)中使用了TPN方法。

二、iBright FL1500 Western熒光成像分析儀適用的TPN技術(shù)方案

      電轉(zhuǎn)印結(jié)束后，首先要確認(rèn)全部蛋白質(zhì)被正確轉(zhuǎn)移到膜上，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)印跡中任何空泡和轉(zhuǎn)印不均等異常情形，改進(jìn)存在的問題電泳和電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)步驟重新實(shí)驗(yàn)。而對Blot各泳道蛋白條帶的可視化處理，既是Blot驗(yàn)證的需要，同時(shí)也是在為進(jìn)行TPN處理做成像準(zhǔn)備。

      驗(yàn)證蛋白Blot的一種常見做法是印跡的麗春紅S (Ponceau S)染色（染色的Blot經(jīng)沖洗后可繼續(xù)執(zhí)行印跡免疫檢測）。染色過程耗時(shí)約20分鐘不算長，但麗春紅S與蛋白質(zhì)結(jié)合持續(xù)時(shí)間短，須迅速完成圖像采集，否則染色條帶逐漸褪色后條帶信號(hào)強(qiáng)度降低，使總蛋白的定量失準(zhǔn)。操作時(shí)間限制，這僅是麗春紅S染色法的技術(shù)缺陷而已。

      在我們看來，麗春紅S染色法用于蛋白Blot條帶總蛋白定量，方法的選擇上就不妥。它本不應(yīng)該被如此高調(diào)、理所當(dāng)然地用于蛋白Blot的定量分析（注：SDS-PAGE凝膠定量例外）。

      PubMed收錄期刊發(fā)文中，采用NIH ImageJ Software（也叫Fiji）進(jìn)行Western Blot圖像分析的文章數(shù)以萬計(jì)。ImageJ使用指南中關(guān)于朗珀-比爾定律在圖像定量分析應(yīng)用的說明，想必知悉詳情的研究人員不在少數(shù)。對于蛋白Blot條帶這類樣品圖像信號(hào)值與樣品測試成份含量關(guān)聯(lián)問題，指南指出，不透明樣品用反射光源照明生成的圖像，因樣品表面對光源散射、反射，使得這部分來自光源的信號(hào)連同圖像有效信號(hào)一同被采集形成分析圖像，其圖像信號(hào)強(qiáng)度并不能代表待測樣品有效含量。因此，對于蛋白Blot用反射白光照射生成的染色圖像來定量總蛋白，不符合朗珀-比爾定律，定量結(jié)果準(zhǔn)確性就更值得商榷。

      根據(jù)ImageJ指南說明，蛋白Blot這類樣品檢測，應(yīng)該是基于樣品本身發(fā)射的熒光、化學(xué)發(fā)光（生物發(fā)光）信號(hào)形成的圖像進(jìn)行定量分析。故采用ECL發(fā)光、熒光染料標(biāo)記所獲取的蛋白Blot圖像作為蛋白定量依據(jù)，可謂是恰得其所。

       可用于蛋白Blot熒光標(biāo)記染料，如SYPRO Ruby（SYPRO寶石紅）等，不僅相對昂貴，還需固定、隔夜染色和脫色一系列精細(xì)操作處理，其過程耗時(shí)而繁瑣。

      反觀伯樂Stain-Free免染凝膠、Invitrogen No-Stain 免染型蛋白染色試劑代表的新型免染成像技術(shù)，不僅與下游免疫印跡檢測流程完全兼容，可在短短2分鐘內(nèi)完成蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印效率的驗(yàn)證，而且條帶熒光信號(hào)強(qiáng)度不受染色或脫色操作時(shí)間影響，信號(hào)穩(wěn)定。這極大加快、簡化Western Blot條帶可視化和總蛋白定量過程。

      那iBright FL1500系統(tǒng)是否支持所有免染蛋白熒光成像技術(shù)方法？回答是：不全部支持。

       伯樂Stain-Free免染膠蛋白熒光成像技術(shù)的核心是在手灌SDS-PAGE凝膠或商品化預(yù)制膠中添加了一種三鹵化合物。該化合物與蛋白質(zhì)分子中的色氨酸殘基共價(jià)結(jié)合，不干擾電泳或轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)。三鹵化合物自身不產(chǎn)生熒光，而它與蛋白質(zhì)共價(jià)復(fù)合物經(jīng)302nm紫外激發(fā)能產(chǎn)生熒光，且熒光信號(hào)持續(xù)貫穿于凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜全過程，便于成像分析。

      而iBright FL1500配置缺少必要的反射式UV激發(fā)光（標(biāo)配LED綠色透射光激發(fā)光源不適用），無法激發(fā)伯樂的Stain-Free免染凝膠完成TPN分析，故只能使用Invitrogen No-Stain免染蛋白染色試劑。

      Invitrogen No-Stain蛋白標(biāo)記試劑與蛋白分子的賴氨酸側(cè)鏈部分形成共價(jià)鍵，可在每孔上樣 1–80μg總蛋白的上樣量范圍內(nèi)保持優(yōu)良的檢測線性。該試劑可使用UV、綠色LED（Ex 520 mm）或藍(lán)色LED（Ex 488 mm）光源激發(fā)，發(fā)射波長為590 nm。

      iBright FL1500同時(shí)配置有LED綠色透射光源（用于透明SDS-PAGE凝膠的激發(fā)）、反射式藍(lán)（Epi-LED 455-485nm）、綠（Epi-LED 515-545nm）激發(fā)光（蛋白轉(zhuǎn)印膜的染料激發(fā)）和波長范圍568-617nm的熒光發(fā)射濾光片，可完美勝任蛋白凝膠、蛋白印跡的Invitrogen No-Stain蛋白免染熒光標(biāo)記成像和對蛋白Blot的TPN檢測。

三、Western Blot TPN方法應(yīng)用的iBright FL1500熒光檢測通道方案

      基于《英捷iBright FL1500 Western熒光成像分析儀技術(shù)特點(diǎn)解析-1》的討論意見，iBright FL1500的Em3、Em4兩個(gè)檢測通道只能二選一。而Western Blot實(shí)驗(yàn)引入Invitrogen No-Stain熒光染料進(jìn)行TPN校正后，為確保各靶蛋白條帶、泳道上總蛋白熒光信號(hào)的特異性，TPN需單獨(dú)占用EM2發(fā)射信號(hào)通道。

iBright FL1500印跡熒光成像分析儀熒光檢測通道配置

      iBright FL1500可供分配給各蛋白條帶熒光信號(hào)檢測的通道只有EM 1、EM 3（或Em 4）、Em 5三個(gè)。這正是iBright FL1500系統(tǒng)配置5個(gè)熒光通道，但引入TPN方法后最多只能同時(shí)測3個(gè)靶蛋白的原因。
       其中，EM 1綠色熒光通道在檢測基質(zhì)復(fù)雜樣品Blot時(shí)，很可能還會(huì)受到背景熒光的干擾。為改善檢測信噪比，選擇靶蛋白熒光二抗時(shí)，可參考以下經(jīng)驗(yàn)做法：低豐度靶標(biāo)，盡量用亮度較亮的短波長熒光基團(tuán)標(biāo)記二抗（如Alexa Fluor 546和Alexa Fluor Plus 647）；而高豐度靶標(biāo)，則選用波長較長熒光基團(tuán)標(biāo)記抗體（如Alexa Fluor Plus 680和Alexa Fluor Plus 800）。
       至于如何在Western Blot實(shí)驗(yàn)中獲取免染熒光標(biāo)記Blot總蛋白圖像，且聽《英捷iBright FL1500 Western熒光成像分析儀技術(shù)特點(diǎn)解析-3》為您分解。

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