基于應(yīng)用的多功能熒光酶標(biāo)儀選型-3

 （續(xù)：激酶活性HTRF檢測(cè)的熒光酶標(biāo)儀解決方案-上）

二、HTRF技術(shù)對(duì)測(cè)試儀器系統(tǒng)的要求

       Cisbio Bioassays公司（2019年4月并入美國(guó)PE/PerkinElmer）不生產(chǎn)測(cè)試儀器，而是通過對(duì)PerkinElmer、Biotek、BMG、Molecular Devices、Tecan、Thermo Scientific等主流品牌制造商的多功能熒光酶標(biāo)儀實(shí)施HTRF檢測(cè)資質(zhì)認(rèn)證的方式，借船出海，讓HTRF技術(shù)應(yīng)用一路保持著乘風(fēng)破浪、行穩(wěn)致遠(yuǎn)的態(tài)勢(shì)。

       為HTRF技術(shù)應(yīng)用保駕護(hù)航的，是Cisbio為HTRF專利技術(shù)建立的一套檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系。該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)測(cè)試用儀器硬件配置、系統(tǒng)工作參數(shù)設(shè)置和數(shù)據(jù)處理方法等都有完整而詳盡規(guī)定。

2.1 HTRF檢測(cè)對(duì)儀器硬件條件的要求

       HTRF技術(shù)是依托TRF、FRET兩種熒光分析方法建立的，故執(zhí)行HTRF測(cè)試的儀器，從光源、光路配置、檢測(cè)器及軟件系統(tǒng)設(shè)置，除要適應(yīng)TRF、FRET檢測(cè)要求，還要符合HTRF檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

       HTRF抑或TRF，都基于測(cè)試信號(hào)與普通熒光、樣品背景熒光的衰減時(shí)間(fluorescence decay time)的巨大差異原理，在熒光激發(fā)和信號(hào)檢測(cè)兩個(gè)動(dòng)作間引入一個(gè)50 - 150μs的檢測(cè)時(shí)間延遲，待被散射的激發(fā)光和短壽命樣品自發(fā)熒光自然消退殆盡，再測(cè)定FRET機(jī)制釋放的熒光信號(hào)。用時(shí)間門控的方法排除非特異熒光的干擾，來實(shí)現(xiàn)高信噪比、高靈敏度。此外，HTRF、TRF技術(shù)都用了鑭系元素離子型配合物作熒光標(biāo)記，測(cè)試所用的激發(fā)、發(fā)射濾光片配置基本一致。只不過，HTRF需加一組檢測(cè)光學(xué)元件以測(cè)定第二發(fā)射熒光信號(hào)。而HTRF與FRET雖檢測(cè)原理方法一致，但具體細(xì)節(jié)則大相徑庭。

       歸納起來，滿足HTRF認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)的多功能熒光酶標(biāo)儀，硬件配置有以下特點(diǎn)。

2.1.1 檢測(cè)光源

       HTRF檢測(cè)光源可以采用閃爍氙燈（Xenon flash lamp）或高能激光器（TRF laser）。

       氙閃燈閃光頻率高（最大200Hz），波長(zhǎng)分布范圍廣（240 -1200nm）。其中檢測(cè)常用的紫外（200-320nm）、可見光譜（430-680nm）兩個(gè)區(qū)間能量處于較高水平。而鑭系元素穴狀化合物激發(fā)波長(zhǎng)為340nm。因此，氙閃燈用作HTRF檢測(cè)是經(jīng)濟(jì)易行的光源來源。但缺點(diǎn)是能量分布均勻，特別是320 - 340nm區(qū)帶的能量輻射相對(duì)較弱。

       而波長(zhǎng)337nm的TRF激光器，能量集中，樣品激發(fā)充分，對(duì)強(qiáng)、弱兩種信號(hào)的辨識(shí)度增強(qiáng)，檢測(cè)的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍都有改進(jìn)。此外，每次快閃式激發(fā)結(jié)束后，能量消退迅速，沒有閃爍氙燈常見的能量消退“長(zhǎng)尾”，故激光器脈沖引入的背景持續(xù)時(shí)間短、強(qiáng)度弱。只需更少激發(fā)頻次，即可達(dá)到檢測(cè)積分效果。實(shí)測(cè)表明，TRF激光器激發(fā)一次采集的熒光信號(hào)足以媲美常規(guī)氙閃燈激發(fā)10次采集信號(hào)積分效果，可在36秒內(nèi)完成1536孔板測(cè)定，有顯著速度優(yōu)勢(shì)并保持Z'>0.8的測(cè)試質(zhì)量。這是HTRF檢測(cè)系統(tǒng)引入TRF激發(fā)光源的價(jià)值所在。

2.1.2 傳輸光路

       HTRF檢測(cè)光路須是濾光片架構(gòu)(filter-based)，通常系統(tǒng)配置專用一組340nm激發(fā)濾光套件(Excitation filter set)、620/665nm兩組發(fā)射濾光片組件(Emission filter set，含二色分光鏡)。VantaStar、FluoStar Omega、EnVision、SpectraMax iD5、Synergy NEO2、Infinite F Plex系統(tǒng)均采用此配置思路。

       MD的SpectraMax i3x、SpectraMax Paradigm多功能熒光酶標(biāo)儀，因?yàn)椴捎玫墓庠?光路集成式卡盒式模塊化設(shè)計(jì)，因此只需選擇HTRF專用檢測(cè)卡盒(0200-7011)，其內(nèi)置符合Cisbio HTRF測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)的氙閃燈、傳導(dǎo)光路設(shè)計(jì)和616nm, 665nm兩組特異性發(fā)射濾光片，可實(shí)現(xiàn)即插即用。

2.1.3 信號(hào)檢測(cè)器

       HTRF與FRET、BRET檢測(cè)，都需對(duì)能量的供體、受體兩個(gè)發(fā)射熒光信號(hào)進(jìn)行采集測(cè)定。理論上，為避免樣品因時(shí)間不同、激發(fā)能量波動(dòng)、檢測(cè)器自身工作暗電流波動(dòng)產(chǎn)生的噪音干擾，兩組信號(hào)應(yīng)該實(shí)施同步測(cè)量。為此，通常測(cè)試儀器要求是雙重濾光光路、雙PMT配置來并行測(cè)量 2 個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)，即同步雙發(fā)射(Simultaneous Dual Emission，SDE)測(cè)定。主流品牌多功能熒光酶標(biāo)儀中，BMG VantaStar、FluoStar Omega、Polarstar Omega、PerkinElmer EnVision HTS和Agilent BioTek Synergy NEO2屬于這種情況。

       SDE不僅降低測(cè)試值%CV，同時(shí)更有利于HTS應(yīng)用。實(shí)際上，HTRF技術(shù)開發(fā)過程中，正是依托SDE檢測(cè)平臺(tái)進(jìn)行的。

       目前，除經(jīng)典SDE同步測(cè)定方法，非同步測(cè)定方法——Two sequential measurements（TSM）也已被Cisbio HTRF標(biāo)準(zhǔn)體系采納。所謂TSM，即兩種熒光信號(hào)按（受體）發(fā)射熒光—供體發(fā)射熒光的順序分為兩次、連續(xù)循環(huán)測(cè)定方法（Sequentially measure the two emissions one after the other）。

       HTRF檢測(cè)中，Eu³⁺等鑭系元素穴狀化合物發(fā)射熒光壽命不過1000 μs，而測(cè)試儀器PMT檢測(cè)時(shí)間窗口（Window time or Integration time）長(zhǎng)達(dá)400-600 μs，已基本覆蓋或代表了的黃金采樣窗口。在一個(gè)采樣循環(huán)時(shí)間內(nèi)，顯然無法按順序依次完成供體熒光、受體熒光信號(hào)采集。故兩種信號(hào)的測(cè)定只能分步進(jìn)行：第一個(gè)激發(fā)周期（cycler或flash）的600μs窗口檢測(cè)供體信號(hào)，第二個(gè)激發(fā)周期采集受體熒光信號(hào)。只要確保每個(gè)采樣周期設(shè)定參數(shù)一致，系統(tǒng)工作狀態(tài)基本穩(wěn)定，則從兩個(gè)連續(xù)周期分別測(cè)得的兩個(gè)熒光信號(hào)，與在一個(gè)周期內(nèi)同時(shí)采集的兩種熒光信號(hào)，理論上等效。Tecan Infinite F200 PRO 、MD SpectraMax iD5系統(tǒng)的HTRF認(rèn)證測(cè)試程序中， 620 nm、665 nm兩種信號(hào)數(shù)據(jù)就是基于TSM模式得來的。

       這表明，作為TR-FRET技術(shù)中特例，HTRF檢測(cè)檢測(cè)數(shù)據(jù)，既可以用經(jīng)典SDE方法測(cè)定產(chǎn)生，也可以是TSM非同步連續(xù)測(cè)定完成。這等于宣示：造價(jià)相對(duì)低廉的單PMT配置系統(tǒng)同樣可以申請(qǐng)HTRF檢測(cè)認(rèn)證。

2.2 HTRF檢測(cè)對(duì)應(yīng)用程序設(shè)置的要求

       Cisbio對(duì)MD、Tecan、PE、BioTek和BMG等品牌測(cè)試儀器的HTRF認(rèn)證應(yīng)用程序，會(huì)因各儀器配置、技術(shù)性能、默認(rèn)運(yùn)行參數(shù)設(shè)置不一，實(shí)行了個(gè)性化量程定制的HTRF檢測(cè)協(xié)議，以確保檢測(cè)數(shù)據(jù)質(zhì)量符合Cisbio的信噪比、DF%、CV%、靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍等多項(xiàng)認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)。資料顯示，即便是相同HTRF應(yīng)用，如Europium cryptate donor/ Red acceptor readout，不同儀器HTRF測(cè)試協(xié)議中諸多參數(shù)設(shè)置互不兼容。

       我們首先看看HTRF檢測(cè)協(xié)議都有哪些核心要素。

2.2.1 檢測(cè)脈沖數(shù)（Number of flashes）

       在對(duì)單個(gè)樣品測(cè)定過程中，激發(fā)光源的一個(gè)開啟激發(fā)關(guān)閉動(dòng)作、一個(gè)短暫待機(jī)和檢測(cè)器的一個(gè)啟動(dòng)信號(hào)采集到停止動(dòng)作，這三個(gè)內(nèi)容組成的一整套測(cè)試活動(dòng)可稱為一個(gè)閃光（flash）、脈沖（pulse）、讀數(shù)（read）或一個(gè)檢測(cè)循環(huán)周期（cycle）。

       每一個(gè)樣品孔通常都包括許多個(gè)重復(fù)脈沖動(dòng)作。不同儀器設(shè)定的脈沖數(shù)有差別（10-200個(gè)）。

2.2.2 激發(fā)時(shí)間（Excitation Time）

       激發(fā)光源在每個(gè)脈沖中持續(xù)工作激發(fā)樣品時(shí)間，稱為激發(fā)時(shí)間。

       HTRF檢測(cè)中，閃爍氙燈用的是50μs固定時(shí)間，確保樣品充分激發(fā)。高能激光器脈沖激發(fā)能量集中而強(qiáng)度高，檔次激發(fā)時(shí)間可縮短至數(shù)微秒。

2.2.3 檢測(cè)延時(shí)（Integration delay/Measurement delay/Lag time）

       激發(fā)光源關(guān)閉后、檢測(cè)器啟動(dòng)熒光信號(hào)采集前有一段無光電操作的空白時(shí)間，稱為時(shí)間延遲。

       通過測(cè)量時(shí)間延遲，就可以在激發(fā)光、待測(cè)樣品基質(zhì)自發(fā)短壽命熒光（1-10ns）全部衰變后，消除其干擾，得到背景極低而信噪比極佳的特異性熒光強(qiáng)度測(cè)值。

2.2.4 檢測(cè)時(shí)間（Integration Time）/信號(hào)采集窗口時(shí)間(time of windows）

       是指在一個(gè)脈沖中，從檢測(cè)器啟動(dòng)信號(hào)采集工作到結(jié)束信號(hào)采集這段時(shí)間長(zhǎng)度，稱為積分時(shí)間或檢測(cè)窗口期。

       每個(gè)樣品孔要?dú)v經(jīng)10次以上的脈沖，而每個(gè)脈沖的積分時(shí)間是固定的。

       PMT光譜響應(yīng)特性（同一個(gè)制造商生產(chǎn)同一種型號(hào)光電倍增管，光譜響應(yīng)特性也不完全一樣）、量子效率（Quantum Efficiency）、暗電流變化（限制了對(duì)弱光信號(hào)的檢測(cè)的分辨能力，即靈敏度）、信號(hào)響應(yīng)時(shí)間（把光脈沖轉(zhuǎn)換并輸出光電脈的時(shí)間，約10ns）等性能影響對(duì)測(cè)量結(jié)果大。積分時(shí)間需綜合信號(hào)強(qiáng)度、暗電流噪音、Delta F幾個(gè)指標(biāo)動(dòng)力學(xué)特性才能確定。最佳積分時(shí)間方案是噪聲最小化的同時(shí)Delta F 最大化。資料顯示，SpectraMax iD5系統(tǒng)最佳積分時(shí)間為在500 μs至1000 μs范圍內(nèi)，噪聲最小化而Delta F較高。

       測(cè)試表明，隨著脈沖次數(shù)增加，Delta F 值顯示出變異性較小趨勢(shì)（CV 越好），同時(shí)背景噪音減少，檢測(cè)限提高。因此，優(yōu)化每孔樣品的積分時(shí)間和脈沖數(shù)這兩個(gè)參數(shù)可提示系統(tǒng)檢測(cè)性能。

       每個(gè)樣品測(cè)度時(shí)間為（測(cè)試板位置機(jī)械移動(dòng)、定位的時(shí)間不計(jì)入）：

        （延遲時(shí)間+積分時(shí)間）×脈沖數(shù)量 = 單孔樣品檢測(cè)時(shí)間。

2.2.5 信號(hào)增益調(diào)節(jié)（Gain）

       Gain即光電倍增管的增益。PMT通過光電陰極面接收光信號(hào)將光子能量轉(zhuǎn)換成光電子后，經(jīng)過多次聚集、加速、轟擊而實(shí)現(xiàn)電子數(shù)目疊加倍增，在PMT陽(yáng)極端輸出電流，而PMT的輸出電流大小和入射光子數(shù)成正比。

       PMT增益用末端輸出電流與前段陰極電流比值表示，可理解為電流的倍增率。通常，增加PMT陰陽(yáng)兩極的工作電壓，則增益增加。

       PMT自動(dòng)增益調(diào)節(jié)功能，是指儀器根據(jù)樣品信號(hào)強(qiáng)度，自動(dòng)選擇合適的PMT工作電壓。此外，PMT允許手動(dòng)增益優(yōu)化設(shè)置。增益調(diào)節(jié)的作用是系統(tǒng)可在一定數(shù)量級(jí)別內(nèi)同時(shí)穩(wěn)定測(cè)定高、低信號(hào)相差7個(gè)數(shù)量級(jí)上的不同樣品。

2.2.6 Z軸高度調(diào)整（Z-position）/讀板高度（Read height）

       HTRF檢測(cè)要將高能激發(fā)光源、測(cè)試探頭都精準(zhǔn)聚焦于樣品上，以實(shí)現(xiàn)有效激發(fā)和信號(hào)采集。Z軸-聚焦調(diào)整功能，能優(yōu)化讀板的Z-高度，以適應(yīng)不同通量、孔樣品直徑、樣品頁(yè)面高度的測(cè)試板的檢測(cè)，減少測(cè)試信號(hào)損失，并降低孔間串?dāng)_。

表1 Cisbio HTRF認(rèn)證的HTRF檢測(cè)專用參數(shù)設(shè)置

       根據(jù)表1內(nèi)容，我們可以作如下解讀：

       1）不同品牌多功熒光能酶標(biāo)儀的檢測(cè)脈沖數(shù)、延遲時(shí)間、積分時(shí)間不同，使得單孔樣品檢測(cè)效率不同。按HTRF檢測(cè)速度從高到低將表中五款機(jī)型排序，結(jié)果是：Infinite F200 PRO ＞Synergy NEO2 ＞ EnVision HTS ＞ SpectraMax iD5 ＞ FluoStar Omega；

       2）依據(jù)單孔樣品信號(hào)檢測(cè)時(shí)間參數(shù)，按測(cè)試靈敏度從高到低這5款機(jī)型排序結(jié)果為：FluoStar Omega ＞ EnVision HTS ＞ SpectraMax iD5 ＞ Synergy NEO2 ＞ Infinite F200 PRO；

       3）為Ciobio HTRF檢測(cè)建立的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試protoco中，延遲時(shí)間、積分時(shí)間、脈沖次數(shù)之間存在制約、互補(bǔ)關(guān)系。以FluoStar Omega、Polarstar Omega為例，雖然時(shí)間延時(shí)少（60 μs），積分時(shí)間短（400 μs），但脈沖次數(shù)多（200次）。而SpectraMax iD5時(shí)間延時(shí)長(zhǎng)（100 μs），積分時(shí)間長(zhǎng)（600 μs），但脈沖次數(shù)少（50次）。因此，確保每個(gè)樣品的總積分效果在不同平臺(tái)間測(cè)試結(jié)果的可比性、可靠性。這正是Cisbio HTRF認(rèn)證創(chuàng)建個(gè)性化檢測(cè)協(xié)議的魅力和意義之所在。

       相比為各品牌不同型號(hào)的多功能熒光酶標(biāo)儀擬定千篇一律測(cè)試協(xié)議的指南規(guī)范，Ciobio的HTRF標(biāo)準(zhǔn)體系采用“一機(jī)一議、因機(jī)施策”的方法，顯然更科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)、更具可行性。

 (續(xù)：激酶活性HTRF檢測(cè)的熒光酶標(biāo)儀解決方案-下)