基于應(yīng)用的多功能熒光酶標(biāo)儀選型-3

       均相時(shí)間分辨熒光技術(shù)(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence，HTRF) 是法國(guó)Cisbio公司（2019年并入美國(guó)PE）融合熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET）和時(shí)間分辨熒光（Time-Resolved Fluorescence, TRF）兩種技術(shù)基礎(chǔ)上創(chuàng)建的一種TR-FRET分析方法。最早的報(bào)導(dǎo)見(jiàn)于G Mathis在1993年9月Clin Chem (IF 12.1670)的《Rare earth cryptates and homogeneous fluoroimmunoassays with human sera》一文。

       HTRF、FRET及TR-FRET分析技術(shù)，研究的都是納米尺度空間內(nèi)兩種或多種生物分子間的特異性相互結(jié)合、相互作用的關(guān)系。但HTRF技術(shù)在測(cè)試穩(wěn)定性、靈敏度、簡(jiǎn)便性和高通量兼容性上，具有特殊優(yōu)勢(shì)。在制藥企業(yè)、科研院所藥物研究中心的新藥研發(fā)中，HTRF已成為開(kāi)展藥物靶標(biāo)結(jié)合的動(dòng)力學(xué)分析、高通量高親和力化合物篩選最受歡迎方法之一。

       生物醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)，HTRF技術(shù)在受體與配體、蛋白與蛋白、蛋白與核酸間的結(jié)合及作用機(jī)制分析等得到廣泛應(yīng)用。它是激酶活性檢測(cè)，如絲氨酸、蘇氨酸激酶(serine/threonine kinases，STK)活性檢測(cè)、細(xì)胞膜G蛋白偶聯(lián)受體(G-Protein Coupled Receptor， GPCR)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理（如G蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)/G-protein cascades）和功能分析（細(xì)胞中IP1或cAMP定量），蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction, PPI），基因表達(dá)調(diào)控，表觀遺傳學(xué)（如組蛋白修飾活性），細(xì)胞因子，炎癥、代謝性疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病中異常信號(hào)通路生物標(biāo)志物分析（如人腦tau蛋白聚集）等研究的重要手段。

       2019年以來(lái)，幾乎每年Acta Pharm Sin B都有HTRF應(yīng)用文章發(fā)表。2022.01-2022.08，就已刊發(fā)了多篇中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院、清華大學(xué)、沈陽(yáng)藥科大學(xué)、中山大學(xué)科研團(tuán)隊(duì)的HTRF檢測(cè)應(yīng)用有關(guān)報(bào)告。                                              

       本文嘗試討論以下4個(gè)問(wèn)題：1）HTRF技術(shù)對(duì)其它同類(lèi)熒光測(cè)定方法的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)；2）HTRF技術(shù)對(duì)測(cè)試儀器有何特殊要求；3）將HTRF技術(shù)用于激酶活性分析等分子互作實(shí)驗(yàn)過(guò)程中多功能熒光酶標(biāo)儀的選型策略；4）HTRF與其他TR-FRET測(cè)定技術(shù)在檢測(cè)程序上的兼容性。

一、HTRF分析與TRF、FRET、TRF-FRET技術(shù)和而不同

       青取之于藍(lán)而青于藍(lán)，冰水為之而寒于水。

       HTRF技術(shù)源于TR-FRET技術(shù)，但在TRF鑭系元素?zé)晒獠牧蠎?yīng)用、FRET近紅外熒光標(biāo)記的選擇和熒光信號(hào)校正方法三方面都有重大創(chuàng)新發(fā)明。

1.1 新型鑭系陽(yáng)離子穴狀化合物熒光供體的應(yīng)用

       鑭系元素也稱(chēng)稀土元素（Rare earth element），如銪(europium, Eu)、鋱(terbium, Tb)、釤(samarium, Sm)等，對(duì)紫外可見(jiàn)光吸收弱，難以被直接激發(fā)產(chǎn)生檢測(cè)效用的熒光。通過(guò)鑭系陽(yáng)離子自身的配位化學(xué)鍵，與有紫外吸收功能的有機(jī)化合物配體結(jié)合，組成中心為鑭系陽(yáng)離子、外圍為有機(jī)配體、具有特殊構(gòu)象的配位化合物。外圍配體吸收紫外輻射能量后傳遞給位于中心的鑭系陽(yáng)離子，后者即可發(fā)射斯托克位移（Stoke's shift）大、峰形窄，壽命長(zhǎng)的熒光（這種現(xiàn)象稱(chēng)為“天線(xiàn)效應(yīng)”）。

        三價(jià)陽(yáng)離子Eu³⁺ 、Tb³⁺ 、Sm³⁺的配位數(shù)多達(dá)8-9個(gè)。不同配體與鑭系陽(yáng)離子構(gòu)成的配位化合物復(fù)合體構(gòu)象存在復(fù)雜多樣性。不同復(fù)合體空間構(gòu)象在減少周?chē)橘|(zhì)環(huán)境發(fā)光淬滅效應(yīng)、維持熒光穩(wěn)定性效用存在差別。

        而樣品溶液中的生物大分子（如核酸、蛋白質(zhì)芳香殘基），乙二胺四乙酸（EDTA）、具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的有機(jī)配體等，或因與鑭系陽(yáng)離子結(jié)合敏化鑭系陽(yáng)離子發(fā)光，或因淬滅作用，會(huì)改變熒光發(fā)射特性。

       常規(guī)TRF分析中的熒光標(biāo)記物多為Eu³⁺、Tb³⁺螯合物（Chelates）。復(fù)雜樣品基質(zhì)成分干擾，溶液溫度和pH值條件的波動(dòng)、高濃度的Mg²⁺等金屬陽(yáng)離子以及EDTA、二甲基亞砜（DMSO）等添加劑的存在，常導(dǎo)致鑭系元素螯合物熒光檢測(cè)信號(hào)很大不穩(wěn)定。

       HTRF技術(shù)的FRET熒光供體為有特殊空間構(gòu)象的穴狀化合物Eu³⁺ cryptate、Tb³⁺ cryptate。它們是以含2,2'-聯(lián)吡啶基團(tuán)（2,2’-bipyridine groups）的巨多環(huán)（macropolycycic）外圍骨架作光吸收配體、中央空腔嵌入鑭系元素離子構(gòu)成的。其籠狀結(jié)構(gòu)可為結(jié)構(gòu)中心的Eu3+ 、Tb3+離子提供強(qiáng)大保護(hù)。而聯(lián)吡啶基團(tuán)的結(jié)合有助于分子內(nèi)高效能量轉(zhuǎn)移和提升量子效率。特別是采用Eu³⁺內(nèi)核時(shí)，標(biāo)記物在生物介質(zhì)中具有優(yōu)良的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，對(duì)樣品基質(zhì)和溶液成分的耐受力極強(qiáng)。無(wú)熒光漂白現(xiàn)象，可允許連續(xù)數(shù)日對(duì)同一樣品進(jìn)行多次重復(fù)測(cè)定。因此，不僅可用于熒光強(qiáng)度的終點(diǎn)測(cè)定（Endpoint measurement），還適用于樣品熒光的動(dòng)力學(xué)分析（kinetic measurement）。這是普通鑭系元素螯合物TRF試劑難以實(shí)現(xiàn)的。

1.2 高效能FRET能量受體XL665和d2的應(yīng)用

       熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）利用能量供體（Donor）、能量受體（Acceptor）兩種熒光基團(tuán)，分別標(biāo)記有可能相互結(jié)合的兩個(gè)生物分子。生物分子發(fā)生結(jié)合后，其攜帶的Donor、Acceptor得以靠近到10nm以?xún)?nèi)。此時(shí)，供體與受體之間產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移，供體部分能量轉(zhuǎn)移給了Acceptor，后者吸收能量即發(fā)射熒光。樣品將會(huì)被同時(shí)檢測(cè)到兩種熒光信號(hào)：一種是能量供體被檢測(cè)光源激發(fā)后釋放的強(qiáng)度較強(qiáng)、峰值620nm熒光，另一種是受體發(fā)出的強(qiáng)度較弱、峰值665nm紅色（或520nm的綠色）熒光。相反，如待測(cè)的兩種生物分子間未發(fā)生結(jié)合，標(biāo)記供體、受體的兩個(gè)熒光基團(tuán)因空間距離過(guò)大將無(wú)法發(fā)生FRET，受體將處于靜默狀態(tài)，無(wú)熒光釋放，此情況下，只檢測(cè)到發(fā)自供體的一種熒光。

       FRET技術(shù)優(yōu)勢(shì)在于，實(shí)驗(yàn)中無(wú)需將未結(jié)合的、游離狀態(tài)的檢測(cè)分子移除，無(wú)需洗板步驟直接測(cè)定，簡(jiǎn)化了操作，且有利于整合移液工作站、儲(chǔ)板機(jī)和多功能熒光酶標(biāo)儀，實(shí)現(xiàn)全程自動(dòng)化、高通量FRET檢測(cè)。

       HTRF技術(shù)中，F(xiàn)RET熒光受體有兩種，即XL665和d2。二者分子量不同，熒光光譜特征完全相同：不僅半衰期非常長(zhǎng)，激發(fā)波長(zhǎng)620 nm，發(fā)射波長(zhǎng)665 nm,Stroke's shift > 300 nm,發(fā)射光譜處于紅外區(qū)，可進(jìn)一步降低生物溶液中其它生物分子本底熒光干擾。XL665即別藻藍(lán)蛋白（Allophycocyanin, APC）為超靈敏熒光染料，具有極高的量子產(chǎn)率，比傳統(tǒng)有機(jī)熒光團(tuán)靈敏度高百倍。d2是第二代FRET能量受體用熒光標(biāo)記物，分子量較小，可減少空間位阻對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。

1.3 FRET雙熒光比值校正法的應(yīng)用

       HTRF與其它TR-FRET產(chǎn)品的區(qū)別還在于對(duì)兩種熒光測(cè)試值的專(zhuān)利比值處理方法。

       測(cè)定620 nm供體和 665 nm受體發(fā)射的兩種熒光強(qiáng)度后，用665/620（受體/供體）的比率計(jì)算Delta F（%），表示每個(gè)樣本的FRET能量轉(zhuǎn)移率。

       專(zhuān)利的比值測(cè)量校正了孔與孔間因移液誤差所致的樣品填充量差異、不同樣品濃度或測(cè)量?jī)x器激發(fā)能量波動(dòng)引起的誤差，并消除來(lái)自測(cè)定組分的介質(zhì)干擾和淬火帶來(lái)的干擾。這個(gè)歸一化處理措施，提高了靈敏度并降低測(cè)試值的CV%。(待續(xù))