基于應用的多功能熒光酶標儀選型-2

 （續(xù)：雙熒光素酶報告基因檢測之多功能熒光酶標儀解決方案-上）

二、DLR檢測對測試儀器性能的特殊要求

       在螢光素酶（如螢火蟲螢光素酶，海腎螢光素酶或NanoLuc螢光素酶）催化底物氧化的反應中，的確也存在420nm波長附近的發(fā)信號光峰，但整體光譜分布范圍極寬泛。如只選擇最大發(fā)射峰檢測而濾掉其他波段的信號，則會造成發(fā)光信號大量損失。此外，真核生物來源細胞、組織等不發(fā)光或樣品自身的背景熒光信號極低。故在螢光素酶檢測中，應盡可能地收集整個可見光譜（380–650 nm）信號，避免使用光柵、濾光片裝置濾除來自樣品信號，以確保檢測的靈敏度。這是DLR檢測跟魯米諾類衍生物的酶促反應發(fā)光等其他化學發(fā)光、BRET/NanoBRET生物發(fā)光等檢測上的重要區(qū)別。

       DLR檢測的化學反應過程中，海腎螢光素酶與螢火蟲螢光素酶催化反應的發(fā)光信號強度有效范圍一般可達6-8個數量級。

       資料顯示，使用純化的螢火蟲和海腎螢光素酶混合物、Promega GloMax 20/20發(fā)光檢測儀測量發(fā)光信號，螢火蟲螢光素酶報告基因酶的檢測極限為1×10^-21 mol螢光素酶，海腎螢光素酶的檢測限約3×10^-19 mol海腎螢光素酶。

表1 Promega公司發(fā)光檢測儀的測試性能參數

       表1顯示：Promega自創(chuàng)各型號發(fā)光檢測系統(tǒng)，PMT的感光波長范圍達到了350–700nm，測試線性范圍至少覆蓋8個數量級，測試靈敏度低至1×10^-21 mol熒光素酶（約0.002 amol/well,96孔）。

       此外，DLR檢測需在白色多孔板上進行，是為更好地收集發(fā)光信號，并減少孔間信號的竄擾。

       同時，無論是基于光柵光路還是基于濾光片光路的發(fā)光檢測系統(tǒng)，都不適用于DLR檢測。

表2  品牌微孔板測讀儀發(fā)光檢測性能參數

       對比表2所列的幾款發(fā)光酶標儀、多功能熒光酶標儀在發(fā)光測定的性能指標可發(fā)現，因檢測器線性動態(tài)響應范圍、檢測靈敏度差異，并非市面所有多模式微孔板檢測儀都可勝任DLR檢測。

       Promega 推薦使用經DLR認證的檢測系統(tǒng)（帶有 DLReady標識，系統(tǒng)軟件整合了標準DLR檢測應用程序）進行DLR檢測。無論是單管發(fā)光檢測儀或微孔板發(fā)光讀板儀，建議配備兩個試劑進樣器，以實現兩種試劑交替操作的無縫銜接。

三、用作DLR檢測的多功能熒光酶標儀經濟型方案

       目前，市面取得DLReady認證的發(fā)光檢測儀、發(fā)光酶標儀類產品屈指可數。

       物以稀為貴。

       無論一次只能進行單管測定的GloMax 20/20，還是可以96孔板批量測定的GloMax Navigator發(fā)光酶標儀，都售價不菲。國內公開信息顯示，GloMax Navigator售價高達4萬美元，已跟經典濾光片光路類多功能熒光酶標儀市價比肩。

       因此，購置GloMax Navigator發(fā)光酶標儀，則不如考慮帶熒光、發(fā)光和光吸收功能的且具有DLReady認證的多功能熒光酶標儀(注：有數十個機型可用，詳見promega英文網站有關內容)。

表3  部分DLReady認證的品牌多功能熒光微孔板測讀儀

品牌 型號	BMG Fluostar Omega	MD SpectraMax iD3	Tecan Infinite F Plex	BioTek Synergy HTX
外觀
檢測器	Side-on PMT	-5℃ PMT	PMT	PMT
測定樣品類型	6-384-well plate	6-384-well plate	6-384-well plate	6-384-well plate
讀取位置	Top/Bottom read	Top-read	Top-read	Top-read
檢測發(fā)光類型	Glow/Flash	Glow/Flash	Glow/Flash	Glow/Flash
波長范圍	240～740 nm	300 - 650 nm	/	300～700nm
檢測下限 (mol 熒光素)	20 amol/well ATP	10 pmol/well ATP	225 amol ATP/well (9 pM;384孔板)	60 amol ATP/well
檢測動態(tài)范圍	>9 logs	>7 logs	/	>6 logs
孔間光串擾	/	<0.1% (半量96孔白板)	<0.1% (半量96孔白板)	/
注射器數量	2	2	2	2
注射器移液范圍	3～500μl (±1μl)	1～max (±1μl)	最大800μl (±1μl)	5～1000μl (±1μl)

       表3所列4個機型中，Tecan Infinite F200 PRO系列Infinite F Plex為單一濾光片光路架構，同時具有熒光、熒光偏振、發(fā)光檢測功能的熒光酶標儀（無光吸收測定功能）。

       BMG Fluostar Omega和BioTek Synergy HTX均為雙光路架構，即同時具有光柵光路（用于光吸收測定）、濾光片光路（用于熒光、發(fā)光檢測，其中濾光片輪中預留有發(fā)光檢測專用的空濾光片位，避免了濾光片對發(fā)光型號的過濾阻攔）。

       MD SpectraMax iD3與Fluostar Omega、Synergy HTX不同，其光吸收、熒光檢測波長的選擇是由光柵單色器（而非后二者采用的經典濾光片光路）完成的，發(fā)光檢測模塊則采用了單獨檢測光路。

       基于《熒光強度檢測的多功能熒光酶標儀方案-下》的觀點，采用相同功能配置時，SpectraMax iD3的售價將會高于Fluostar Omega、Synergy HTX市價。而Infinite F Plex，盡管采用的是濾光片光路，但因FP功能模塊存在，市價將絕非四款機型中的較低者。

參考文獻：

［1］E1910 和E1960 Dual-Luciferase Reporter Assay System 技術手冊中文版(2020,CTM040)

［2］GloMax 20/20 Luminometer Instructions For Use (Rev 11/12)

［3］GloMax Explorer System Operating Manual (Rev 6/22)

［4］Omega Family of Readers Operating Manual (Rev G)

［3］Instructions for Use for Infinite 200 PRO（Rev 1.6）

［5］SpectraMax Mini Multi-Mode Microplate Reader User Guide (5090339 B)

［6］SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader User Guide（5054747 H）

［7］Synergy HTX Operator's Manual (Rev A)

［8］Simon T.M. Allard,  Kevin Kopish. Luciferase Reporter Assays: Powerful, Adaptable Tools For Cell Biology Research. Cell Notes, 2008, Issue 21.