（續(xù)熒光強度檢測的多功能熒光酶標(biāo)儀方案-上） 

二、濾光片式多功能熒光酶標(biāo)儀

2.1 濾光片熒光光路系統(tǒng)的特點

       濾光片光路系統(tǒng)具有高光通量，光損耗少，高信噪比的優(yōu)點。隨著濾光片新材料的應(yīng)用和工藝改進(jìn)，人們已可根據(jù)檢測要求對激發(fā)、發(fā)射光濾光片的截止波長、帶寬進(jìn)行特殊優(yōu)化組合（帶寬可以從10- 50nm的大范圍內(nèi)選擇），以獲得最佳的信噪比。因此，從熒光酶標(biāo)儀誕生以來，濾光片光路系統(tǒng)就成了熒光檢測的標(biāo)配，特別是FP、TRF、TR-FRET等對靈敏度要求極高的應(yīng)用。

       濾光片系統(tǒng)還有一個優(yōu)勢就是濾光輪可以快速切換濾光片，同步檢測兩種熒光信號，如典型的鈣離子流檢測、BRET雙波長熒光比例分析等檢測，這些都是基于光柵單色器的系統(tǒng)所不能完成的。因此，濾光片熒光檢測系統(tǒng)的應(yīng)用更廣。

       此外，基于濾光片光路的多功能熒光酶標(biāo)儀還具有價格便宜的優(yōu)勢。

       當(dāng)然，熒光染料檢測光譜特征不同，不同試劑盒、不同應(yīng)用中的熒光檢測波長不一。而濾光片型酶標(biāo)儀無論是配置濾光片輪抑或是抽插式濾光片滑條，考慮到發(fā)光檢測所需的1個空白位，實際可加載的濾光片至多不過5個。這樣將難以避免有部分實驗會因缺少相應(yīng)波長的濾光片套件而無法進(jìn)行。而濾光片單獨購買、更換擦著，卻并非所有品牌機型的新手可輕而易舉完成。

表2多功能熒光酶標(biāo)儀標(biāo)準(zhǔn)濾光片配置一覽

品牌 型號	Molecular Devices SpectraMax Mini	Tecan Infinite F Plex	Biotek Synergy LX	BMG FluoStar Omega	Promega GloMax Explorer
熒光模塊
濾光片容量	1個	4個	2個	8個	5個
Blue	Ex 360/35nm Em 465/35nm Coumarin/AMC, AF350	用戶自定義	Ex 360/40nm Em 460/40nm (MUB, caspace-3)	Ex 355/35nm Em 460/35nm	Ex 405nm Em 500/5nm
Green	Ex 485/20nm Em 535/25nm (Fluorescein/FITC)	Ex 485/20nm Em 528/20nm (Fluorescein,   EGFP)	Ex 485/20nm Em 528/20nm (Fluorescein,   EGFP)	Ex 485/20nm Em 528/20nm	Ex 475nm Em 525/25nm
Red	Ex 535/25nm Em 595/35nm (Alamar blue, PI)	用戶自定義	EX 530/25nm EM 590/35nm (Alexa Fluor 546/CY3)	EX 544/35nm EM 590/35nm	Ex 525/20nm Em 610/30nm
NIR	/	用戶自定義	/	EX 584/35nm EM 620/10nm mCherry,Alexa Fluor 594	Ex 620/40nm Em 690/30nm CY5, Alexa Fluor 680

       標(biāo)配的濾光片不夠用，可能是這類多功能熒光檢測系統(tǒng)的最大短板?？v然BMG FluoStar Omega裝備有8位濾光片輪（標(biāo)配4對檢測濾光片），與QuantStudio 5、QuantStudio 7 Flex實時熒光定量PCR儀的6個熒光檢測通道能把Fluorescein, VIC, TAMRA/Cy3, Texas Red,Cy5, Cy5.5五種代表性染料全覆蓋比，也望塵莫及。

       而化解這一困境的辦法其實很簡單。

       用戶可根據(jù)主要測試任務(wù)和常用試劑盒的熒光染料類別，增配若干個空濾光模塊（每個熒光模塊都具有數(shù)量不等的激發(fā)-二分鏡-發(fā)射濾光組件安裝位置），再從增配相應(yīng)波長的濾光片就水到渠成。以Synergy LX為例，從310/20nm開始到818/40nm，以波長10或20nm幅度遞增，有數(shù)十種濾光片可供選配或定制。

       表2也告訴了人們一個基本事實：廠商提供的初始標(biāo)配大體是一致的，采用的是RGB三色熒光配置。說明，這樣設(shè)計可照顧常用染料的熒光測定要求，用戶DIY優(yōu)化配置的額外工作并不復(fù)雜。

2.2 熒光強度檢測常用多功能熒光酶標(biāo)儀方案

      目前，基于濾光片光路設(shè)計的主流品牌多功能熒光酶標(biāo)儀機型包括了以下幾款。

表3 多功能熒光酶標(biāo)儀主要測試性能指標(biāo)一覽表

品牌 型號	MD SpectraMax Mini	Biotek Synergy LX	Tecan Infinite F Plex	BMG FluoStar Omega
外觀
預(yù)裝濾光片數(shù)	3	3	自定義	4
激發(fā)波長(Ex)	250～850nm	320～700nm	230～850nm	240～740 nm
發(fā)射波長(Em)	250～850nm	320～700nm	280～850nm	240～740 nm
熒光檢測器	低溫PMT	PMT	PMT	PMT
檢測靈敏度	1 pmol/well fluorescein	2 pmol/well  fluorescein	頂讀0.85 pmol/well (100μl, 384孔板) 底讀5.0 fmol/well (200μl,96孔板)	0.2 fmol/well fluorescein
檢測動態(tài)范圍	6 decades	6 decades	/	8 decades
恒溫孵育功能	RT+5℃～45℃	RT+5℃～50℃	RT+5℃～42℃	RT+5℃～45℃
微孔板振蕩功能	線性、圓周和雙圓周	線性、圓周和雙圓周	線性、圓周	線性、圓周和雙圓周
可選配注射器	否	否	是	是

(注：1 pmol =10³ fmol = 10⁶ amol)

       整體看，表中所列四款機型的測試功能旗鼓相當(dāng)，都具備熒光強度測定、發(fā)光檢測、紫外可見吸光度測定、動力學(xué)分析功能，且都有微孔板振蕩模塊和維持樣品室恒溫功能。

       就熒光檢測靈敏度、檢測動態(tài)范圍兩項指標(biāo)而言，BMG公司 FluoStar Omega多功能熒光酶標(biāo)儀要更勝一籌，其次是Tecan Infinite F Plex。此外，考慮到雙自動進(jìn)樣器在動力學(xué)測定、雙熒光素酶報告基因分析中的重要作用，儀器應(yīng)用的可擴(kuò)展性也優(yōu)于MD SpectraMax Mini、Biotek Synergy LX兩機型。

       根據(jù)近年國內(nèi)公開渠道的信息，Synergy LX、Infinite F Plex兩款機型，標(biāo)準(zhǔn)出廠配置（不含標(biāo)配之外的光學(xué)模塊、實際進(jìn)樣器）情況下，售價低于30萬元。

參考文獻(xiàn)：

［1］Omega Family of Readers Operating Manual (Rev G)

［2］GloMax Explorer System Operating anual (Rev 6/22)

［3］Instructions for Use for Infinite 200 PRO Rev 1.6

［4］SpectraMax Mini Multi-Mode Microplate Reader User Guide (5090339 B)

［5］Synergy 2 Multi-Mode Reader Operator's Manual (Rev K)

［6］Xavier Amouretti. 多功能微孔板發(fā)光酶標(biāo)儀：基于濾光片系統(tǒng)，基于單色器系統(tǒng)，還是合二為一？