基于應(yīng)用的多功能熒光酶標(biāo)儀選型-1

       相對(duì)于檢測(cè)比色皿、試管內(nèi)樣品用的熒光光度計(jì)，人們把具有96、384、1536孔板的高通量熒光信號(hào)檢測(cè)功能的熒光檢測(cè)儀稱作熒光酶標(biāo)儀或微孔板熒光讀板機(jī)。

       熒光（fluorescence）與發(fā)光（luminescence，包括化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光）的檢測(cè)用的都是能將極微弱光信號(hào)連續(xù)十倍放大、并轉(zhuǎn)換為可被測(cè)量電流的器件-光電倍增管(Photomultiplier Tube，PMT)。而發(fā)光反應(yīng)，無須任何光源激發(fā)即可釋放光能。因此，熒光酶標(biāo)儀通常天然地具備發(fā)光檢測(cè)功能。此外，再配上光柵單色器（monochromator）-光電二極管（Photodiode）檢測(cè)模塊，還可進(jìn)行樣品200-850nm范圍光吸收峰掃描（spectral scanning）、任意波長(zhǎng)的紫外可見光吸光度測(cè)定。這種同時(shí)具備熒光、發(fā)光和吸光度三種測(cè)定功能的熒光酶標(biāo)儀，習(xí)慣稱之為多功能熒光酶標(biāo)儀、多功能微孔板檢測(cè)儀、多模式微孔板讀板機(jī)(Multi-Mode Microplate Reader)。

       為滿足藥物靶點(diǎn)篩選、分子生物學(xué)應(yīng)用、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究等分析要求，業(yè)內(nèi)已開發(fā)的多功能熒光酶標(biāo)儀，如BioTek Synergy Neo2，Molecular Devices SpectraMax iD5與SpectraMax i3x，BMG CLARIOstar Plus和Tecan infinite F Plex（200 Pro系列）等，無論是內(nèi)部光路結(jié)構(gòu)（波長(zhǎng)選擇方式有濾光片式、雙光柵式、4光柵、光柵+濾光片組合式；檢測(cè)器類型有光電二極管+單PMT型，二極管+雙PMT型，二極管+4PMT型）。相應(yīng)地，檢測(cè)功能也得到極大拓展。除熒光強(qiáng)度（Fluorescence intensity，F(xiàn)I）、紫外可見吸光度（UV-Vis absorbance，ABS）、熒光、發(fā)光基本功能，還增加了熒光偏振（Fluorescence polarization，F(xiàn)P）、時(shí)間分辨熒光（Time-resolved fluorescence，TRF）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）、生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET）、均相時(shí)間分辨熒光(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence，HTRF)，AlphaScreen & AlphaLISA等多種熒光分析方法）。讀數(shù)模式（由簡(jiǎn)單的終點(diǎn)式Endpoint、動(dòng)態(tài)讀取和光譜掃描, 擴(kuò)充到逐孔多點(diǎn)掃描well area scanning、多波長(zhǎng)掃描燈）、讀板方法（常規(guī)ABS、微孔板頂部讀取Top reading、微孔板底部讀取bottom reading）更多樣化。此外，為確保樣品測(cè)定狀態(tài)的穩(wěn)定，往往還集成了樣品振蕩處理、檢測(cè)室溫度控制和細(xì)胞等特殊樣品通氣保護(hù)模塊。

       先進(jìn)的光學(xué)元件、靈活的系統(tǒng)架構(gòu)，加功能強(qiáng)大的數(shù)據(jù)采集與分析軟件，讓多功能熒光酶標(biāo)儀在微量DNA/RNA及蛋白紫外純度濃度測(cè)定、ELISA/酶學(xué)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)、細(xì)胞活力和毒性觀測(cè)、激酶等藥物靶點(diǎn)分析、報(bào)告基因檢測(cè)等眾多領(lǐng)域獲得日益廣泛的應(yīng)用。

       因此，用于熒光檢測(cè)的酶標(biāo)儀選型，應(yīng)充分結(jié)合實(shí)際分析技術(shù)類型和樣品的具體要求來考慮。本篇從最基礎(chǔ)的熒光強(qiáng)度測(cè)定入手，討論目前主流多功能熒光酶標(biāo)儀的可選方案。

       就實(shí)現(xiàn)熒光強(qiáng)度測(cè)定的技術(shù)路線，多功能熒光酶標(biāo)儀可分為經(jīng)典型濾光片波長(zhǎng)選擇系統(tǒng)（filter-based）和光柵單色器（monochromator-based）波長(zhǎng)選擇系統(tǒng)兩種類型。

一、光柵型多功能熒光酶標(biāo)儀

1.1 光柵型熒光酶標(biāo)儀的特點(diǎn)

       這一類熒光酶標(biāo)儀的熒光強(qiáng)度檢測(cè)，通常使用羅蘭凹面反射光柵基于光學(xué)衍射原理把白色復(fù)合光源分解成一系列連續(xù)、扇形排列的單色光譜區(qū)帶，再經(jīng)狹縫選取其中特定光譜區(qū)間的單色光束用作熒光激發(fā)光照射樣本。同樣地，樣品發(fā)射的熒光，經(jīng)光柵-狹縫選擇過濾后，其中特異波長(zhǎng)范圍的光被輸送到PMT檢測(cè)器用于測(cè)定。光柵由步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)下轉(zhuǎn)動(dòng)角度，被分解的單色光依次從狹縫出射，即可得到連續(xù)、不同波長(zhǎng)的單色光。這種光柵系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，選取的光波長(zhǎng)范圍較窄，光色純正、雜散光少。                                              

       光柵型熒光酶標(biāo)儀的主要優(yōu)勢(shì)有三點(diǎn)。

       首先是測(cè)試波長(zhǎng)選擇具有極大靈活性。實(shí)驗(yàn)者可分別針對(duì)不同熒光染料激發(fā)、發(fā)射光譜屬性，任意選擇最靈敏的測(cè)試波長(zhǎng)。

       其次，單色器可以進(jìn)行熒光光譜掃描(Spectrum)。光譜掃描檢測(cè)設(shè)置中，既可以固定激發(fā)波長(zhǎng)(Excitation)而連續(xù)掃描樣品發(fā)射波長(zhǎng)(Emission)，獲得樣品在連續(xù)多個(gè)波長(zhǎng)處的檢測(cè)峰值分布，也可以固定發(fā)射波長(zhǎng)(Emission)而掃描樣品的激發(fā)波長(zhǎng)(Excitation)峰。這特別有利于鑒定新的熒光物質(zhì)或在某些分析中染料激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)遷移，對(duì)優(yōu)化測(cè)試條件和改進(jìn)測(cè)試性能具有重要價(jià)值。

       再次，是光柵單色器所提供的光譜帶寬普遍較窄。市面多數(shù)熒光檢測(cè)光柵提供的是5nm-20nm波長(zhǎng)跨度的單色光。窄帶寬可確保光色純正，對(duì)具有窄發(fā)射峰的熒光探針（如Invitrogen Qdot這類納米熒光探針）的檢測(cè)和進(jìn)行多色熒光檢測(cè)，可減少信號(hào)串?dāng)_，提高測(cè)試結(jié)果的特異性。

       凡事有利就有弊。

       由于眾多熒光染料的激發(fā)光和發(fā)射光光譜的分布在較寬泛的波長(zhǎng)范圍。對(duì)這類熒光的檢測(cè)，較寬帶寬更有助于增強(qiáng)激發(fā)響應(yīng)、熒光發(fā)射能量，往往改進(jìn)熒光檢測(cè)靈敏度和獲得更低的檢測(cè)限。而無論是光柵光路的激發(fā)光，還是樣本釋放的發(fā)射熒光，與濾光片光路比，收窄的波長(zhǎng)區(qū)帶，會(huì)造成激發(fā)或發(fā)生峰處于半峰寬(光譜峰高一半處的峰寬度稱半寬度，full width at half maxima/FWHM)以外范圍的光能損耗。

       光柵帶寬越窄，激發(fā)、發(fā)射熒光信號(hào)被濾掉的有效信號(hào)越多，必然在一定程度上降低檢測(cè)準(zhǔn)確性和靈敏度。

       這一點(diǎn)在業(yè)內(nèi)早有定論。

       只要將同一品牌、同一型號(hào)和同一臺(tái)機(jī)器上安裝的光柵光路和濾光片光路對(duì)同一個(gè)樣品熒光的檢測(cè)數(shù)據(jù)對(duì)比，即可清楚地證明。

表1 光柵光路與濾光片光路檢測(cè)靈敏度對(duì)比表

       正因?yàn)榇?，不僅是TRF、BRET、TR-FRET/HTRF、AlphaScreen & AlphaLISA等對(duì)熒光檢測(cè)靈敏度要求較高的分析，對(duì)檢測(cè)帶寬有特定要求化學(xué)發(fā)光DLR分析認(rèn)證，都將光柵光路技術(shù)法拉黑剔除。

1.2 熒光強(qiáng)度檢測(cè)用的光柵型熒光酶標(biāo)儀方案

       基于光柵單色器架構(gòu)的熒光酶標(biāo)儀，多見于中高端的多功能熒光酶標(biāo)儀系統(tǒng)中。

       目前主流品牌多功能熒光酶標(biāo)儀中，定位于熒光強(qiáng)度測(cè)定這一基礎(chǔ)功能的機(jī)型并不多。這其中有美國(guó)MD SpectraMax iD3，Tecan Infinite E Plex、PE Ensight等。

       光柵型熒光酶標(biāo)儀的售價(jià)通常都顯著高于采用經(jīng)典濾光片光路的同類產(chǎn)品。公開的信息表明，這類機(jī)型的市場(chǎng)價(jià)普遍均在35-40萬(wàn)元區(qū)間。

       因此，若以熒光強(qiáng)度測(cè)定為主要目標(biāo)，光柵型熒光酶標(biāo)儀從價(jià)位上看未免過于昂貴。

（待續(xù)）