(續(xù)：生物醫(yī)學(xué)樣品微量紫外光度測(cè)定的技術(shù)原理和方法-中)

五、Implen NanoPhotometer液滴壓縮技術(shù)

       通常，低鹽樣品（脫鹽后的蛋白溶液）、非極性溶劑、去污劑（如SDS、Triton X100）殘留或樣品溫度升高，均可導(dǎo)致液體表面張力顯著降低。依賴液體表面張力維持樣品的測(cè)試光路穩(wěn)定的方法，很容易因溶液張力特征變化而致液柱拉伸失敗，造成測(cè)試誤差或難以獲得有效數(shù)據(jù)。特別是純化后的蛋白質(zhì)樣品，表面張力低同時(shí)基質(zhì)成分復(fù)雜，微量蛋白質(zhì)的可靠測(cè)量向來都是充滿挑戰(zhàn)的任務(wù)。

       德國Implen公司是業(yè)內(nèi)微量紫外可見光度計(jì)領(lǐng)域僅次于NanoDrop的著名廠商。所開發(fā)的NanoPhotometer系列微量紫外可見光度計(jì)全部采用的是由鉸鏈可開合密封上蓋和可控制升降的樣品基座組成的密封性檢測(cè)池。上蓋正中為石英玻璃反光鏡，基座中央為石英玻璃光學(xué)測(cè)試窗。樣品滴加到檢測(cè)窗口，測(cè)試光束從底座的測(cè)試窗向上穿過樣品后抵達(dá)頂蓋，被反光鏡反射后折回，再次通過樣品、測(cè)試窗口進(jìn)入檢測(cè)器。上下兩個(gè)石英表面間距的2倍即測(cè)試光程的長(zhǎng)度。微量測(cè)定功能的核心原理是獨(dú)特的液滴樣品壓縮技術(shù)（Sample Compression Technology）。

       所謂樣品壓縮技術(shù)是指：測(cè)試液滴添加到檢測(cè)池中測(cè)試窗口，放下密封上蓋后，液滴夾在基座、頂蓋反光鏡之間被擠壓成薄膜。膜的形成是測(cè)試表面對(duì)液體的物理擠壓所致，與液體自身的表面張力屬性無關(guān)，徹底擺脫測(cè)試光路對(duì)表面張力的依賴。而薄膜厚度可由底座的升降運(yùn)動(dòng)來控制，調(diào)整基座高度即可控制膜的厚度，即實(shí)現(xiàn)對(duì)測(cè)試光程的調(diào)節(jié)。                                              

       Implen采用兩個(gè)固定的錨點(diǎn)來定義路徑長(zhǎng)度（True Path控制技術(shù)）。如圖所示，基座在錨點(diǎn)1時(shí)，基座-鏡面間距大，測(cè)試光路徑長(zhǎng)?；Ａ粼阱^點(diǎn)2時(shí)，基座-鏡面間距縮小，液滴更趨扁平，此時(shí)測(cè)試路徑較短?；涤纱盆F控制只能在兩個(gè)固定錨點(diǎn)之一定位，無法在除兩個(gè)錨點(diǎn)之外的任何位置停留。這樣確保了測(cè)試光程的精確設(shè)定，而不發(fā)生漂移。

       NanoPhotometer微量紫外可見光度計(jì)還為核酸和蛋白質(zhì)的測(cè)定引入了自動(dòng)光程設(shè)定功能（Automatic Path Length Setting）：通常，先在較長(zhǎng)光程下測(cè)量，根據(jù)測(cè)得的樣品吸光度，判定樣品是否在路徑長(zhǎng)度的有效線性范圍內(nèi)。如樣品濃度超出該范圍，儀器將自動(dòng)以較短的路徑長(zhǎng)度重新測(cè)量。系統(tǒng)自動(dòng)選擇適宜光程，確保測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

Implen NanoPhotometer微量紫外可見光度計(jì)測(cè)試光程表

六、其他微量紫外光度測(cè)定技術(shù)和方法

6.1 NanoPhotometer測(cè)定原理類似技術(shù)

       德國Hellma公司的Traycell 2.0，是專為紫外可見分光光度計(jì)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)池架開發(fā)的、可用于微量核酸蛋白樣本測(cè)定的石英比色皿。

       將樣品滴加到比色皿頂部的光學(xué)窗口，上蓋，與配套比色皿適配器組合后，安裝到標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)池架即可。測(cè)試完成，簡(jiǎn)單擦拭比色皿光學(xué)窗口和上蓋，即可進(jìn)行下一個(gè)樣品的測(cè)定。使用方法上，與NanoDrop One/One C、Implen NanoPhotometer NP80/60/50系列微量紫外可見光度計(jì)如出一轍。加樣和清理樣品殘留時(shí)，無需從檢測(cè)池架上取出TrayCell比色皿，比色皿與測(cè)試光束的相對(duì)位置始終保持不變，以測(cè)試結(jié)果的可重復(fù)性。

       TrayCell比色皿由主體部分（相當(dāng)于NanoPhotometer的樣品基座）、帶反射鏡的密封蓋組成。主體部分嵌入光纖，用于傳導(dǎo)測(cè)試光束和接收樣品檢測(cè)的信號(hào)。因此，其工作原理、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與Implen NanoPhotometer頗有相似之處。

       測(cè)定前，比色皿需要一定的準(zhǔn)備操作：

       通常情況下或預(yù)估樣品濃度較低時(shí)，首先用1.0mm的光程測(cè)定。選擇較薄的適配器（安裝到比色皿底部）和數(shù)字標(biāo)示為10的上蓋（測(cè)定吸光度值相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)10mm比色皿測(cè)定值之1/10，相當(dāng)于樣品進(jìn)行了10倍稀釋）；

       測(cè)定濃度較高的樣品時(shí)，直接采用0.2mm光程方案測(cè)定，選擇安裝較厚的適配器和標(biāo)示50的上蓋（表明其稀釋因子為1:50）。

       測(cè)試光程（即樣品層厚?。┎煌枳畹蜆悠敷w積存在一定差別：0.2mm光程的TrayCell容量為0.7 - 4μL，1mm光程的TrayCell樣本容量為3 - 5μL。

       給比色皿添加適配器，在eppendorf BioSpectrometer 系列分光光度計(jì)的microcell、日立UH5300紫外微量測(cè)定模塊使用中，都是規(guī)定動(dòng)作。

6.2 NanoDrop測(cè)定原理類似技術(shù)

       這類產(chǎn)品首推eppendorf開發(fā)的Cuvette G1.0微量比色皿。

       G1.0由鋁外殼和帶疏水性涂層的石英玻璃夾層制成，光路長(zhǎng)度1 mm，測(cè)定樣品體積范圍1.5–10μL，主要涉及用于高濃度核酸和蛋白質(zhì)樣品的檢測(cè)。

       G1.0的測(cè)定原理、點(diǎn)樣操作與NanoDrop OneC類似，都是借助測(cè)定界面的疏水作用和液體表面張力維持液柱和測(cè)試光路的穩(wěn)定，光束與液柱法中軸重合、穿透樣品層后進(jìn)入檢測(cè)器完成測(cè)試。每個(gè)樣品測(cè)試結(jié)束，簡(jiǎn)單擦拭檢測(cè)窗口清理。

       Cuvette G1.0與TrayCell兩種比色皿均直接安裝于標(biāo)準(zhǔn)10mm光程檢測(cè)池架上使用。G1.0點(diǎn)樣時(shí)須從檢測(cè)模塊上取下，在桌面完成移液后，重新插回檢測(cè)池中。但G1.0上樣前無須適配器安裝，操作更簡(jiǎn)便。Cuvette G1.0的售價(jià)與國產(chǎn)Nano 400這類固定波長(zhǎng)的微量紫外可見光度計(jì)整機(jī)價(jià)格旗鼓相當(dāng)。但若Hellma TrayCell比， G1.0收的智商稅還算有點(diǎn)良心。

參考文獻(xiàn)：

［1］Eppendorf μCuvette G1.0 Operating instructions

［2］Instructions for use UVette universal adapter

［3］Model Uh5300 Spectrophotometer Instruction Manual (Edition 1)

［4］NanoPhotometer N120/NP80/N60/N50/C40 User Manual (Version 4.3.3)

［5］NanoDrop One Micro-UV/Vis Spectrophotometer User Guide (Revision E)

［6］NanoVue Plus Product User Manual (REV 1.4)

［7］Traycell 2.0 Quick Start Guide