(續(xù)《牛人用伯樂CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀都干了啥？-上》)

8、lncRNA、microRNA表達(dá)分析和RNAi沉默驗(yàn)證（6篇）

       長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類不編碼蛋白，長度可達(dá)200堿基的RNA分子。它們可通過與DNA、RNA及蛋白質(zhì)結(jié)合，參與基因轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄中、轉(zhuǎn)錄后（與轉(zhuǎn)錄物形成互補(bǔ)雙鏈干擾mRNA的剪切）及轉(zhuǎn)錄后翻譯與蛋白質(zhì)磷酸化等過程調(diào)控，影響干細(xì)胞重編排、細(xì)胞分化。

       qRT-PCR測定特定組織和細(xì)胞中LncRNA表達(dá)水平，可分析LncRNAs 的差異表達(dá)模式。同時(shí)測定lncRNA和編碼基因的mRNA表達(dá)水平，可找出表達(dá)顯著相關(guān)的lncRNA-mRNA對(duì)。而基于lncRNA與mRNA表達(dá)相關(guān)性及l(fā)ncRNA與mRNA編碼基因位置關(guān)系，可推測lncRNA對(duì)靶基因的調(diào)控功能。

       研究人員采用CFX Connect熒光定量PCR儀，分別對(duì)軟、硬基質(zhì)條件下培養(yǎng)hPSCs的內(nèi)胚層分化階段特異性基因的誘導(dǎo)、LINC01356、LINC00458的表達(dá)水平的檢測結(jié)果表明：下調(diào)的LINC00458顯著抑制內(nèi)胚層特異性基因FOXA2和SOX17及EOMES和GATA6的mRNA水平，表明LINC00458在內(nèi)胚層響應(yīng)軟底物的分化中發(fā)揮重要作用，而LINC00458缺失會(huì)影響內(nèi)胚層基因表達(dá)，提示它對(duì)軟底物誘導(dǎo)的內(nèi)胚層分化不可或缺。采用ChiP-qPCR方法對(duì)含有內(nèi)胚層特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SMAD2、SMAD3 siRNAs的hPSCs中RIP復(fù)合物中LINC00458、MAL581的檢測表明，軟基質(zhì)培養(yǎng)誘導(dǎo)LINC00458與SMAD3相互作用。研究結(jié)果提示：軟底物誘導(dǎo)的LINC00458是通過SMAD2/3依賴途徑調(diào)節(jié)hPSC內(nèi)胚層的特化。

9、植物基因研究（6篇）

       CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀被用于研究植物組織發(fā)育中起調(diào)控基因（如MADS-Box-基因、homeobox gene同源盒基因、光感受器基因）特異性表達(dá)模式、植物形狀控制等位基因鑒定和植物特殊發(fā)育階段基因QTLs分析等。

10、基因突變的檢測（5篇）

       實(shí)時(shí)熒光定量PCR用于SNP基因型分析和拷貝數(shù)變異(CNV)檢測屬于常規(guī)經(jīng)典應(yīng)用。

11、NGS基因測序文庫的定量（4篇）

       NGS測序所用起始樣本核酸質(zhì)量和靶標(biāo)富集方法不同，使測序文庫濃差異極大。而文庫核酸樣本的精確量化和歸一化，將確保每個(gè)合并文庫測序所需深度，所有樣本達(dá)到所需的測序reads量。用實(shí)時(shí)定量PCR儀和SYBR Green對(duì)經(jīng)多重PCR反應(yīng)制備富集的測序文庫片段定量，測定文庫準(zhǔn)確濃度是NGS分析流程中文庫質(zhì)控的關(guān)鍵步驟。

12、ChIP-qPCR檢測（2篇）

         染色質(zhì)免疫沉淀法（Chromatin Immnoprecipitation，ChIP)是一種基于抗原與抗體免疫雜交原理，用特異性抗體對(duì)染色質(zhì)上結(jié)合的組蛋白、蛋白修飾物、轉(zhuǎn)錄因子、輔因子等特定抗原和與抗原結(jié)合的DNA片段實(shí)現(xiàn)分離富集的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
        ChIP-qPCR技術(shù)則是融合ChIP和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)各自所長。利用抗體特異性富集與特定轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白修飾結(jié)合的DNA 片段，以qPCR儀、SYBR 熒光染料對(duì)與特定蛋白結(jié)合共沉淀的DNA的定量分析。該技術(shù)可原位、真實(shí)地反映目的蛋白或蛋白修飾在特定基因位點(diǎn)的分布和豐度，查找在靶基因啟動(dòng)子上轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的證據(jù)，是分析蛋白之間相互作用、組蛋白修飾對(duì)基因表達(dá)的影響等重要技術(shù)手段。ChIP-qPCR基本檢測流程包括：固定處于特定細(xì)胞周期的活細(xì)胞→染色質(zhì)剪切為不同長度范圍的小片段→利用抗原抗體反應(yīng)對(duì)染色質(zhì)免疫沉淀→蛋白結(jié)合的DNA片段純化→qPCR檢測。
        德國馬普分子生理學(xué)研究所的研究人員對(duì)在減數(shù)分裂中聯(lián)會(huì)復(fù)合體（synaptonemal complex，SC）Pch2（pachytene checkpoint 2，一種細(xì)胞減數(shù)分裂過程粗線期的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)蛋白，屬AAA+ ATP酶）在起始識(shí)別復(fù)合物（Origin Recognition complex，ORC）結(jié)合位點(diǎn)募集機(jī)制的研究中，借助于ChIP描繪出減數(shù)分裂G2/前期Pch2染色體關(guān)聯(lián)圖譜，揭示了Pch2在整個(gè)基因組中的特異性結(jié)合位點(diǎn)。用CFX connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)處于減數(shù)分裂G2/前期階段的ndt80Δ 細(xì)胞中 GAP1、TDH3、PPR1 三個(gè)轉(zhuǎn)錄活性基因位點(diǎn)、各自編碼區(qū)的下游和上游DNA序列進(jìn)行了 ChIP-qPCR 分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Pch2的染色體募集具有減數(shù)分裂特異性和RNA聚合酶II驅(qū)動(dòng)的基因轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域依賴性，Pch2分子中的非催化功能NH2端結(jié)構(gòu)域(NTD) 是Pch2招募到染色體所必需的結(jié)構(gòu)。

13、其它方面的應(yīng)用（4篇）

13.1 非天然堿基半合成生物體基因表達(dá)的檢測

       加拿大Scripps研究所的研究人員采用非自然的堿基對(duì)(unnatural base pair, UBP)合成了一種可儲(chǔ)存遺傳信息并能穩(wěn)定表達(dá)的半合成生物體(semisynthetic organism, SSO)。對(duì)含UBP堿基質(zhì)粒DNA的檢測用的是CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和SYBR Green標(biāo)記法。

13.2 差示掃描熒光法（Differential Scanning Fluorimetry）

       差示掃描熒光法，亦可稱為蛋白熱穩(wěn)定性分析（Protein thermal shift），是利用實(shí)時(shí)定量PCR儀緩慢升溫熔解實(shí)驗(yàn)，根據(jù)熔解過程中實(shí)時(shí)熒光變化，對(duì)多個(gè)基團(tuán)結(jié)合而成化合物或生物大分子的熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，用于篩選能與靶點(diǎn)結(jié)合的小分子藥物、抗體等。測試依托的正是實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)的HRM分析功能。

       研究人員采用SYPRO orange染料在CFX-Connect 系統(tǒng)上完成了與胱硫醚β合成酶 ( cystathionine βsynthase, CBS )為靶點(diǎn)的富含雜環(huán)雜芳香族結(jié)構(gòu)的小分子化合庫篩選。

13.3 降落實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析應(yīng)用

       國內(nèi)學(xué)者報(bào)道了基于降落PCR（touchdown PCR）原理開發(fā)的降落實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析（Touchdown qPCR Assay）方法。采用CFX-Connect結(jié)合EvaGreen 或SYBR Green分別按常規(guī)雙溫循環(huán)法qPCR、Touchdown qPCR法對(duì)低豐度樣品檢測對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果顯示，確認(rèn)了后者在檢測靈敏度、擴(kuò)增效率上的明顯優(yōu)勢（了解touchdown PCR參考《擴(kuò)增條件再優(yōu)化在實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中的意義和有效途徑-下》）。

13.4 染色體構(gòu)象捕獲-實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析(3C-qPCR)

       人們?cè)诨虮磉_(dá)調(diào)控研究中關(guān)注到的是基因及上下游調(diào)控元件線性排列順序。而即有證據(jù)表明，染色質(zhì)之間相互作用，基因表達(dá)可被處于立體空間一定距離范圍的遠(yuǎn)程調(diào)控元件所調(diào)控。

       染色質(zhì)構(gòu)象捕獲（chromosome conformation capture, 3C）技術(shù)正是為研究基因調(diào)控相關(guān)元件在染色質(zhì)內(nèi)空間內(nèi)分布而建立的。其指導(dǎo)思想是：空間相隔一定距離的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子等基因組元件，能通過染色質(zhì)片段間相互作用被帶入到基因的特定區(qū)域，調(diào)控臨近位置的基因轉(zhuǎn)錄。位置相近、可相互作用的兩個(gè)染色質(zhì)片段內(nèi)的DNA片段因此而連接，形成一個(gè)DNA的unction reads。對(duì)被分析的兩個(gè)目標(biāo)基因片段設(shè)計(jì)引物，將這兩個(gè)區(qū)域嵌合而成的junction reads擴(kuò)增，根據(jù)PCR產(chǎn)物評(píng)估目的片段之間相互作用關(guān)系的有無和強(qiáng)度，可找出與不同轉(zhuǎn)錄因子作用的轉(zhuǎn)錄元件及調(diào)控靶區(qū)。分析兩個(gè)片段在的基因組區(qū)域和染色質(zhì)上定位，即可得到DNA間、染色質(zhì)區(qū)段間相互作用關(guān)系圖譜。

       3C主要操作流程包括：與ChIP-qPCR類似細(xì)胞甲醛固定染色質(zhì)結(jié)構(gòu)→限制性內(nèi)切酶將DNA酶切→DNA連接酶對(duì)片段末端連接、蛋白酶K消化所結(jié)合的蛋白質(zhì)，獲得含有相互接觸DNA片段→實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，獲得染色質(zhì)不同位點(diǎn)相互接觸數(shù)據(jù)，分析得出相互作用染色質(zhì)的三維分布圖譜。

三、關(guān)于CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀引入科研實(shí)驗(yàn)的思考

       迄今為止，與CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀有關(guān)的公開研究論文還不到200篇。因經(jīng)驗(yàn)和對(duì)qPCR實(shí)驗(yàn)?zāi)康睦斫獾钠睿疚膶?duì)qPCR實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的歸類難免有不妥之處。但不可否認(rèn)，CFX Connect在實(shí)際應(yīng)用中所跨越深度和廣度，已基本觸及到目前基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)所能開創(chuàng)的空間極限。一款僅配置有雙熒光通道的系統(tǒng)，其展現(xiàn)的應(yīng)用實(shí)力，與任何高配、高價(jià)、高端熒光定量PCR系統(tǒng)比，都已毫不遜色。這一事實(shí)，足以讓人震驚。

       美國哥倫比亞大學(xué)內(nèi)科和外科醫(yī)學(xué)院Gerard Karsenty團(tuán)隊(duì)中一名叫Jianwen Wei的學(xué)者，2015-2016年間，作為第一作者連續(xù)在Cell、Cell Metab上發(fā)了2篇文章。因?qū)崟r(shí)披露美國新冠疫情信息在我國如今已是婦孺皆知的約翰霍普金斯大學(xué)，其下屬一研究團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室用的也正是是CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。某種程度上，也似乎暗示：就實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析實(shí)驗(yàn)而言，儀器熒光通道數(shù)量多寡，可能并非決定實(shí)驗(yàn)成效的關(guān)鍵因素。就調(diào)研所揭示的想象看，CFX Connect的性能表現(xiàn)，對(duì)于渴望在Cell、Cell Metab、Nucleic Acids Res、Nat Ecol Evol、Nat Struct Mol Biol、Nat Commun、J Exp Med、Sci Adv這檔頂流學(xué)術(shù)論壇留名的人們來說，是夠格的。

       實(shí)際上，伯樂CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)的技術(shù)性能，在目前國內(nèi)外同類產(chǎn)品中足夠硬核。這一點(diǎn)，《慧眼識(shí)珠看伯樂CFX connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀》有專門討論。結(jié)合調(diào)研所披露的事實(shí)和CFX Connect與國產(chǎn)同類產(chǎn)品趨同的售價(jià)，在當(dāng)前科研儀器建設(shè)投入偏緊的新形勢下，重新審視實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀規(guī)劃，對(duì)于充分發(fā)揮儀器建設(shè)的財(cái)政支持效能、減少不必要浪費(fèi)，無疑具有積極引導(dǎo)意義。

       進(jìn)口品牌中與CFX Connect同一檔熒光定量PCR儀還有一款，就是ABI的QuantStudio 1（QS 1）。QS1系統(tǒng)檢測模塊配置三個(gè)熒光通道（它拋棄CFX Connect中雞肋般的FRET通道，換上了JUN、ROX、Texas Red染料通用檢測通道）。這對(duì)于多重實(shí)時(shí)定量分析發(fā)燒友而言，上triplex qPCR實(shí)驗(yàn)都已不在話下。雖然CFX Connect、QS 1都用的96×0.2mL熱循環(huán)模塊， 但CFX Connect的模塊最大變溫速率5.0℃/秒，顯然完勝Q(mào)S 1系統(tǒng)的3.5℃/秒。本文沒有選QS1作為范例予以討論，是因截止至發(fā)稿，我們都無法確信在PubMed數(shù)據(jù)庫中收集到足夠數(shù)量的與QS1有關(guān)的qPCR實(shí)驗(yàn)文章。

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