(前續(xù)：APC相襯技術(shù)在細胞顯微成像中運用的技術(shù)原理及啟示——上)

三、APC相襯技術(shù)抑制細胞圖像光暈的技術(shù)原理與優(yōu)勢

       APC，是Apodized Phase Contrast的縮寫。Apodized一詞源于Apod（譯為無足或足部不發(fā)達的動物，無腹鰭或腹鰭不發(fā)達的魚）。光學術(shù)語中，“腳”是指衍射極限成像系統(tǒng)光路中的旁瓣（side-lobes）或側(cè)環(huán)（side-rings）光信號。Apodization是一種用于移除“腳”光學過濾技術(shù)，用于除去衍射圖案邊緣的外環(huán)部分。例如用小孔光闌，將艾里斑周圍的衍射環(huán)濾除，使光斑中心部分通過小孔，以此來實現(xiàn)對光斑的“去腳化”。apodized、apodization都有切趾、變跡、衍射控制等涵義。尼康公司官方將APC命名為切趾相襯（相差）觀察法。

       APC相差觀察法中的“切趾”處理對象是衍射圖像中央暗斑相鄰的兩個條紋。就細胞相差圖像而言，是要切除圍繞在P0暗斑周圍的P1級明環(huán)。對干擾亮環(huán)切除用的是透射光中性濾光技術(shù)，其核心是專門開發(fā)的、同樣安裝與相差物鏡出瞳面的新型APC專用相位板。

       與傳統(tǒng)倒置相差顯微鏡所用經(jīng)典相位板光學結(jié)構(gòu)上的最大區(qū)別在于，APC相位板的共軛環(huán)內(nèi)外（參考《傳統(tǒng)倒置相差顯微鏡在細胞圖像采集中的運用與技術(shù)局限性-下篇》）兩側(cè)分別增加了一大一?。ɑ疑腂環(huán)和C環(huán)）具有50%減光效應的中性密度濾光片（Neutral Density Filter, ND）。

       從位置上看，共軛環(huán)主要接收的是直射參考光，而內(nèi)外兩個ND減光環(huán)則位于大、小尺寸圓孔衍射（分別與細胞、亞細胞結(jié)構(gòu)衍射對應）過程中的小角度衍射光的通路上。

       細胞器等小圓孔衍射中，光衍射角整體偏大，小角度衍射光占比低。而細胞團塊等對應的大圓孔衍射中，大角度衍射光少，小衍射角光占比高。因此，ND減光環(huán)對小角度衍射光量的削弱效能，對大圓孔衍射過程要顯著高于小圓孔衍射過程。

       ND減光環(huán)組要針對的是小角度衍射光，大角度衍射光則得到較完整地保留并可以暢通無阻，而這將對衍射條紋分布格局產(chǎn)生積極影響。

       根據(jù)前面的推論可知，小角度衍射光衰減后有兩個明顯效應：一是圖像整體亮度的降低，二是削弱P1級明環(huán)近心側(cè)的亮度，使P1級明環(huán)的整體亮度中心外移，減輕與P0級暗斑外緣的重疊程度，為呈現(xiàn)P0暗斑的外圍輪廓創(chuàng)造了有利條件。相對而言，考慮到細胞樣品兩種衍射圓孔尺寸差異懸殊及對應明暗條紋分布的差異，ND環(huán)減光技術(shù)的應用，對細胞內(nèi)部線粒體、脂滴、肌動蛋白束和細胞核等亞細胞結(jié)構(gòu)的形態(tài)細節(jié)呈現(xiàn)更為有利。

       優(yōu)化波長照明條件，利用切跖相差工作模式，還實現(xiàn)了如小鼠和人類胚胎和卵母細胞等厚樣品中的纖維結(jié)構(gòu)以及細顆粒構(gòu)造的直接觀察。

       當然，從幾何光學角度看，ND環(huán)減光還屏蔽了亮度極高的竄擾高直射光，降低圖像背景亮度，有助于提高圖像對比度。對比顯示，ND減光環(huán)引入后的圖像視野高光區(qū)亮度下調(diào)十分明顯。

       在切跖相差觀察中，調(diào)整透照光波長，可使細胞器圖像的對比度發(fā)生變化，有助于對人類胚胎卵周間隙顆粒狀結(jié)構(gòu)和細胞體內(nèi)的纖維結(jié)構(gòu)的辨識。使用650 nm帶通濾光片調(diào)制透射光采集的胚胎圖像中，細胞內(nèi)部顆粒對比度高于用450 nm帶通濾光片調(diào)制照明下的顆粒對比度。這是因為衍射光波長增加，明暗條紋間距拉大，白光對暗斑的干擾降低的原因。

       倒置相差顯微鏡的APC相襯觀察法與經(jīng)典PH相襯觀察法，采用相同的聚光鏡環(huán)形光闌，但配套相差物鏡不同。經(jīng)典PH相差物鏡用的是DM或DL系列的PHL、PH1、PH2、PH3物鏡，而APC相襯法用ADM、ADL或ADH系列PHL - PH3相差物鏡，包括10x、20x、40x、60x和100x共5種放大倍率。Nikon公司的基礎(chǔ)型Eclipse TS2-FL倒置熒光/相差顯微鏡、Eclipse TS2R-FL標準型倒置顯微鏡及Eclipse Ti-FL系列研究級高級倒置熒光顯微成像系統(tǒng)均支持APC觀察法應用。

四、APC相襯技術(shù)在細胞顯微成像中運用的啟示

       APC相襯觀察法與Leica 的IPH外置集成相差觀察法，本質(zhì)都是在Frits Zernike經(jīng)典相襯觀察法基礎(chǔ)上的再創(chuàng)新應用，對增進倒置相差顯微鏡技術(shù)性能、推進行業(yè)進步具有重要意義。IPH技術(shù)開發(fā)成功，提高物鏡對多種觀察法的適應性。APC則克服經(jīng)典相襯觀察模式下圖像中局部光亮過度集中造成光暈干擾，改善圖像中細胞外緣形態(tài)的觀察效果，更重要的是，無需熒光染色處理，即可實現(xiàn)對線粒體、脂滴顆粒、纖維結(jié)構(gòu)等亞細胞結(jié)構(gòu)、區(qū)室細節(jié)結(jié)構(gòu)的直接觀察，還可用于較厚樣品的觀察。因此，為提升傳統(tǒng)相差顯微鏡應用效能、提升細胞圖像采集質(zhì)量開辟了一條新的途徑。

       目前，業(yè)界對這一經(jīng)典相襯顯微觀察技術(shù)的改進工作，無論是沿著細胞成像方向?qū)毎麍D像形成過程從原理上做更深入研究，還是對該成像方法所暴露問題針對性解決之道的探索嘗試方面，做的還不夠。

       徠卡IPH技術(shù)，是遵循經(jīng)典技術(shù)原理，利用現(xiàn)代顯微成像系統(tǒng)的無限遠光學系統(tǒng)光路節(jié)點和接口多的優(yōu)勢，調(diào)整相位板在光路中的位置而開發(fā)的。而APC同樣是在經(jīng)典相襯技術(shù)原理范疇內(nèi)，根據(jù)衍射-干涉過程各光學要素及作用規(guī)律的深入分析而實現(xiàn)了技術(shù)迭代改進。可見，即便是已趨成熟的細胞成像技術(shù)原理、方法同樣有再認識、二次開發(fā)的價值和必要性。

       據(jù)報道，利用X射線顯微鏡所特有的對厚樣品直接進行無損高分辨顯微成像潛力，將經(jīng)典相襯技術(shù)與X射線相襯顯微成像結(jié)合而開發(fā)Zernikel X射線相襯顯微成像裝置，用于生物樣品的顯微成像可達到30nm的超高分辨率。而基于經(jīng)典相襯圖像的相位、振幅和像之間的函數(shù)關(guān)系，利用Cycle-GANs深度學習算法開發(fā)的虛擬相襯成像處理方法，可將普通光學明場顯微鏡獲取的細胞明場圖像轉(zhuǎn)換成標準相襯圖像，細胞結(jié)構(gòu)細節(jié)具有極佳效果。而將圖像AI算法與傳統(tǒng)顯微鏡的結(jié)合，有望消除經(jīng)典相差圖像中的光暈現(xiàn)象，提升細胞相差圖像信息對細胞結(jié)構(gòu)功能分析的價值。

       并非只有STED、GSD、SIM、PALM和STORM這些帶著“前沿、新興、高精尖”標簽的技術(shù)體系才值得跟跑和關(guān)注。

       培養(yǎng)細胞觀察過程中常用的4x - 40x物鏡相差物鏡的相位環(huán)規(guī)格有PHL、PH1、PH2之分，使用不同倍率物鏡時通常需檢查和核對聚光鏡環(huán)形光闌與相差物鏡PH標示規(guī)格的一致性，并據(jù)此調(diào)整光路中環(huán)形光闌。Olympus公司CKX53倒置相差相位鏡采用的集成相襯系統(tǒng)（integrated Phase Contrast, iPC)，是針對4x - 40x物鏡物鏡的相位環(huán)規(guī)格特點，而開發(fā)的通用型PH1環(huán)形光闌及相襯滑板CKX3-SLP。實現(xiàn)了在不同放大倍率物鏡間切換觀察而無需反復調(diào)整相襯光闌的簡便化操作。這一應用模塊的技術(shù)含金量并不高，但卻實實在在提升了使用體驗，已成為進口倒置相差顯微鏡行業(yè)的風向標。

       從Olympus開發(fā)的細胞3D成像反轉(zhuǎn)對比技術(shù)（Inversion Contrast，IVC)，到蔡司新型激光掃描共聚焦顯微鏡應用的Airyscan技術(shù)，從日本橫河（yokogawa）公司開發(fā)成功后在激光共聚焦掃描顯微鏡、高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)廣泛使用的雙轉(zhuǎn)盤共聚焦光學技術(shù)（即微透鏡增強型雙轉(zhuǎn)盤掃描技術(shù)，Microlens-enhanced Nipkow Disk Scanning Technology），到美國PE公司開發(fā)用于Opera Phenix高內(nèi)涵成像系統(tǒng)上可支持FRET、鈣離子成像應用的Synchrony光學系統(tǒng)，莫不是以經(jīng)典技術(shù)方法體系為基礎(chǔ)，在痛點和難點牽引下，經(jīng)鍥而不舍努力后善作善成之杰作，實現(xiàn)技術(shù)性能的迭代和彎道超車。在技術(shù)問題上，無所謂新舊冷熱，關(guān)鍵是取決于人們對特定技術(shù)方法體系的基礎(chǔ)認知到底有多全、多深，是否有發(fā)現(xiàn)問題的眼光、正視并解決問題的決心與恒心。

       回到透射光細胞成像話題上來，IVC細胞3D成像技術(shù)，同樣源于經(jīng)典相襯技術(shù)體系。起因是Yoshimasa Suzuki等認為，無論是經(jīng)典相襯觀察技術(shù)，還是尼康公司開發(fā)的APC方法，不能從根本上消除圖像中的光暈。故摒棄傳統(tǒng)的光波相位-振幅調(diào)制法而另辟蹊徑，用“相位-光通量調(diào)制”方法開發(fā)出專用于厚組織樣品3D成像技術(shù)。這一技術(shù)方法的特點是保留了經(jīng)典相襯體系中的透射光環(huán)形光闌而去除物鏡相位板。其理論基礎(chǔ)是光的折射原理。利用透射光經(jīng)折射后光傳播路徑發(fā)生偏移的內(nèi)在規(guī)律，針對10x物鏡入瞳直徑而調(diào)整環(huán)形光闌大小，利用不同透射光傳播方向偏移程度的不同，調(diào)制物鏡入瞳光量和入瞳角度，將觀察對象的折射率、尺寸大小、樣品厚度及表面外形傾斜角度等細微差異以圖像色澤明暗的形式精確呈現(xiàn)。此觀察模式下，類器官、胚胎細胞外形和3D立體構(gòu)型被塑造得栩栩如生。而在經(jīng)典相襯技術(shù)方法中，透射光折射方向偏移這一事實，是學界和產(chǎn)業(yè)界一直忽略的因素。

       實際上，即便APC相位板，技術(shù)上也并非至臻至美。不同細胞群大小尺寸不同，ND減光環(huán)的寬度設(shè)計及光透射率的優(yōu)化，透射照明光源波長優(yōu)化，透射光因傳播方向偏移造成相位板上竄擾污染問題，都還值得我國業(yè)界去探求和解決（感謝許銳偉幫助提供資料）。

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