（前續(xù)：一、相差顯微技術(shù)的基本構(gòu)成要素） 

3、環(huán)形光闌-相位板共軛

       從相襯干涉光路圖看，環(huán)形光闌處于聚光鏡的前焦點(diǎn)平面上。若圓環(huán)狀照明光束平行穿越環(huán)形光闌，被聚光鏡組匯聚成小光斑投射到樣品平面（聚光鏡后焦平面）。從薄而透明的樣品層透射后，大部分光以入射前的傳播方向前行并被物鏡收集和重新聚焦于物鏡像平面。
       兩束照明光源在樣品平面交叉呈現(xiàn)為對稱的X型。環(huán)形光闌光環(huán)的直徑、寬度決定著4條X型光臂間的夾角大小和光束的粗細(xì)。同一個光闌在與不同數(shù)值孔徑的物鏡組合時，物鏡聚光性能差別，使得物鏡后方光路前行角度、直射參考光在相位板上投射角度、位置和面積均產(chǎn)生變化。這就要求物鏡相位板安裝位置、盤面通光面積大小、共軛區(qū)與補(bǔ)償區(qū)直徑大小、位置及寬度都要相應(yīng)調(diào)整，以確保直射參考光、樣品衍射光能各行其道，從相位板設(shè)定區(qū)域穿過，以減少三個分區(qū)間雜散光竄擾。因此。特定環(huán)狀光闌與具有相應(yīng)相位板的物鏡組合，兩種透射光的光路復(fù)合后才能產(chǎn)生明暗對比效果理想的相差圖像。
       業(yè)內(nèi)采用PHL、PH1、PH2、PH3、PH4的方法標(biāo)示環(huán)形光闌的技術(shù)規(guī)格。PH后面的字符或數(shù)字代表與之匹配的相差物鏡數(shù)值孔徑（Numerical Aperture, NA）值。通常，PHL物鏡NA值≤0.13，PH1物鏡NA值≤0.50，PH2物鏡NA值為0.55-1.0，而PH3、PH4物鏡屬于NA大于1.0的60X、100X倍率的油鏡。
       環(huán)形光闌的環(huán)帶寬度、直徑隨著PH數(shù)字增加而加大，而相位板通光區(qū)（共軛區(qū)+補(bǔ)償區(qū)）直徑和寬度則隨PH數(shù)字增加而縮小。一旦調(diào)整相位板在光路中所處位置，則板的總通光面積、共軛環(huán)及補(bǔ)償區(qū)大小、比例均需相應(yīng)重新調(diào)整優(yōu)化，以實現(xiàn)衍射光與直射參考光線的分離與調(diào)制效果最優(yōu)化。而這將意味著物鏡相襯規(guī)格的變化。各品牌廠商的20X相差物鏡通常有20X PH1和20X PH2之分，其內(nèi)涵及道理就在于此。

二、倒置相差顯微鏡相襯元件的運(yùn)用方法和新趨勢

       無論儀器配置、操作使用，都應(yīng)遵從光闌、物鏡相位板規(guī)格匹配原則。如PH1光闌，只能與帶PH1標(biāo)識物鏡配套使用。

       蔡司、徠卡及Olympus等廠商已在常規(guī)40X PH2相差物鏡基礎(chǔ)上開發(fā)出新的40X PH1物鏡。如此一來，10x、20x和40x三個物鏡可以共享相同的環(huán)形光闌。如要在10x、20x、40x倍率物鏡間切換時，無需移動相襯滑塊和環(huán)形光闌對中調(diào)整，可依舊維持相差觀察效果。因此，活細(xì)胞相差圖像采集操作，蔡司Primovert、Leica DMi1、Olympus CKX53等基礎(chǔ)型倒置相差顯微鏡，甚至比Leica DM IL LED、Axiovert 5 TL FL SCB、Olympus IXplore Standard（IX73）等功能復(fù)雜的手動顯微成像系統(tǒng)簡便。

       以蔡司Primovert倒置相差顯微鏡為例，NA 0.4聚光鏡相差滑塊具有PH0、PH1和PH2三個相襯光闌孔位。將PH1光闌置于光路時，Plan-Achromat 10x/0.25 PH1、LD Plan-Achromat 20x/0.3 PH1、LD Plan-Achromat 40x/0.5 PH1三個物鏡皆可與之有效匹配，無需重新調(diào)整滑板的位置。

       Leica DMi1倒置顯微鏡也采用了類似相襯系統(tǒng)設(shè)計。其S40/0.45聚光鏡配置有BF、PH0、PH1和PH2四孔位的相襯滑板，HI PLAN I 10x/0.22 PH1、HI PLAN I 20x/0.30 PH1和HI PLAN I 40x/0.50 PH1三個物鏡具有相同相環(huán)。在相差觀察模式下調(diào)整放大倍率時，只需旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換盤切換10x—20x—40x鏡頭時，無需頻繁變換滑塊相襯光闌。

       相襯光闌與物鏡相位板的嚴(yán)格配套要求，這一點(diǎn)在進(jìn)行顯微鏡系統(tǒng)配置方案制定時應(yīng)格外注意。

       以Axiovert 5倒置顯微鏡相差應(yīng)用套裝為例，聚光鏡相襯滑板（Light Ring Slider 或 Phase Contrast Slider，即環(huán)形光闌在聚光鏡上固定安裝用的可插拔式多孔位條板）LD 0.4 slider標(biāo)配有PH 1環(huán)形光闌，故所配置的三個物鏡（LD A-Plan 5x/0.15 Ph1、LD A-Plan 10x/0.25 Ph1和LD A-Plan 20x/0.35 Ph1）均為PH1相襯相襯。若使用40x倍率相差物鏡，則可選LD Plan-Achromat 40x/0.5 PH1?；蹇瘴蛔銐蚯闆r下，還可增配PH2這類NA值更大、分辨率和靈敏度更高的熒光半復(fù)消色差或復(fù)消色差物鏡。同理，考慮到常用4x物鏡篩選視野的操作習(xí)慣，選取Plan-Achromat 4x/0.1 PH0物鏡時，需同時增配一PH0光闌。 

       常規(guī)手動倒置熒光顯微鏡中，Olympus CKX53略微特殊。它采用的是集成相差（integrated Phase Contrast, iPC）系統(tǒng)設(shè)計。iPC系統(tǒng)由預(yù)對中相襯滑板CKX3-SLP和一組四個相襯物鏡套件（UPLFLN4XIPC NA 0.13/WD 16.4mm、CACHN10XIPC NA 0.25/ WD 8.8mm、LCACHN20XIPC NA 0.4/ WD 3.2mm和LCACHN40XIPC NA 0.55/ WD 2.2mm）組成。相襯滑板CKX3-SLP三個孔位的正中位置安裝有iPH環(huán)形光闌，全部4X-40X四個相差物鏡通用。調(diào)整圖像放大倍率時無需對相差滑板的環(huán)形光闌做任何調(diào)整，并可確保四個相差物鏡下視野圖像高對比度和細(xì)節(jié)高清晰度最佳，操作極簡便。

       Zeiss Axio Observer 7、Leica DMi8、Olympus IXplore Pro等電動控制型高級倒置熒光顯微鏡配備有7-8位電動聚光鏡轉(zhuǎn)盤，一般可安裝多達(dá)4-5個環(huán)形光闌，對相差類型物鏡的選擇上具有更大靈活性。此外，得益于無線遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計，高級研究級倒置顯微鏡的光路節(jié)點(diǎn)和接口更多，不僅可物鏡后光路上進(jìn)行新型內(nèi)置相差對比法（intermediate phase contrast, IPH)，還可引入微分干涉對比(differential interference contrast, DIC)、霍夫曼調(diào)制對比(Hoffman Modualtion Contrast, HMC)、集成調(diào)制對比度（intermediate modulation contrast, IMC）調(diào)制選項，支持多模式的透射光成像。 

三、經(jīng)典相襯觀察法的技術(shù)局限性 

       二戰(zhàn)結(jié)束后，倒置相差顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)實驗中的廣泛應(yīng)用，驗證了相襯顯微技術(shù)發(fā)明的巨大科學(xué)價值。此后，業(yè)界在此基礎(chǔ)上，引入了透射光濾光片（可參考：《倒置顯微鏡細(xì)胞圖像采集中透射濾光片的合理使用》）、水鏡和高性能相差物鏡，使相差圖像的對比度和圖像質(zhì)量提升到新的高度。
        理想情況下，相差圖像代表的是樣品中微觀結(jié)構(gòu)的折射率和厚度的差異。但遺憾的是，相差圖像中普遍存在兩種偽影（artifacts）效應(yīng)——光暈和陰影。
       相位光暈（Phase Halo），即細(xì)胞等相位體的外緣出現(xiàn)的偽影條帶，是一個強(qiáng)度與樣品相反的圍繞著樣品和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的漫反射光環(huán)。當(dāng)目標(biāo)相位體比周圍介質(zhì)暗時，深色的觀察目標(biāo)將在淺背景上出現(xiàn)明亮光暈。而當(dāng)觀察目標(biāo)比周圍介質(zhì)亮?xí)r，淺色目標(biāo)將在較暗背景上出現(xiàn)深色光暈。
       陰影效果（Shading off effect）是指在相位體內(nèi)部呈現(xiàn)的復(fù)雜明暗區(qū)域圖案現(xiàn)象。如觀察目標(biāo)為深色，則其中央（如細(xì)胞核區(qū)域）會出現(xiàn)一明亮環(huán)。反之，如目標(biāo)對象為淺色，則其內(nèi)部會出現(xiàn)一個中央暗區(qū)。

        傳統(tǒng)相差顯微鏡采集圖像存在偽影效應(yīng)問題，給光暈掩飾區(qū)域圖像的真實輪廓和邊界的識別分析帶來很大困難。
        一般認(rèn)為，偽影的出現(xiàn)屬于相襯觀察技術(shù)固有缺陷所致。一個常見的解釋是，偽影的產(chǎn)生與衍射光、直射管跨區(qū)竄擾有關(guān)：少量的部分樣品衍射光經(jīng)過相位板共軛環(huán)區(qū)，其相位發(fā)生了延遲（或提前）。而同時，還有一部分直射光從相位板補(bǔ)償區(qū)透射。由于兩種光線竄擾技術(shù)上在所難免，其疊加到“正?！毕喔蓤D像上的綜合結(jié)果造成了偽影。
        有業(yè)界人士對偽影產(chǎn)生原因有不同理解。其依據(jù)是：對iPS 細(xì)胞觀察中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)物鏡焦點(diǎn)變化時，觀察到圖像中的亮帶從iPS 細(xì)胞的外部移動到細(xì)胞內(nèi)部。而這一現(xiàn)象與晶體礦物光學(xué)實驗中貝克線（Becke line）的光學(xué)特征完全相符。貝克線是指晶體光學(xué)實驗中，在兩種折射率不同的透明晶體交界處觀察到明亮光暈及相對灰暗的條帶。當(dāng)物鏡焦點(diǎn)遠(yuǎn)離樣品時，亮線向折射率較高的一側(cè)晶體移動，當(dāng)焦點(diǎn)與樣品拉進(jìn)時，亮線向折射率較低的介質(zhì)一側(cè)移動。光暈與陰影是細(xì)胞與周圍介質(zhì)的折射率存在差別時發(fā)生的必然現(xiàn)象。
        此外，相襯顯微成像技術(shù)在兩個方面應(yīng)用還存在受到限制。
        1） 相差非常適合樣品厚度為5μm以內(nèi)的薄、無色、透明標(biāo)本的觀察。但如果標(biāo)本非常厚，則會導(dǎo)致相位改變結(jié)構(gòu)疊加后樣品的上層清晰而深層則模糊不清的情形以及樣品外緣光暈干擾。相差圖像對iPSC細(xì)胞、類器官等厚樣品缺少立體層次表現(xiàn)力。
       2 ） 相位板一定程度上損害了物鏡分辨率。盡管相位物鏡非常適合明場工作。但相位環(huán)安裝于物鏡出瞳側(cè)，其共軛區(qū)會阻擋部分光線輸出，而透射光相位偏移還會引起的輕微干涉圖案。因此，相位板的存在使物鏡對高分辨率、高靈敏度、微弱熒光采集能力下降，造成圖像分辨率損害。
        相襯觀察法不僅是應(yīng)用上存在局限性，在理論上也有待完善。如在對相襯顯微成像原理、圖像光暈現(xiàn)象解釋和解決辦法上，業(yè)界和學(xué)界目前還缺少明確而統(tǒng)一的意見。與相襯顯微有關(guān)文獻(xiàn)還基本處于在技術(shù)原理數(shù)理論證層面，缺乏更深入探討和論證。調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，大量公開圖片、資料對相差顯微成像機(jī)制的理解、描述上存在不準(zhǔn)確甚至謬誤之處。

        理論創(chuàng)新和探索基礎(chǔ)的薄弱，制約了業(yè)界對倒置相差顯微成像技術(shù)的改進(jìn)提升空間。

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