相差顯微鏡，即相位對比顯微鏡（Phase Contrast Microscope）、相襯顯微鏡，是基于相襯顯微技術(shù)原理（Phase Contrast Microscopy, PCM）開發(fā)的可將樣品透射光相位信息轉(zhuǎn)換為光振幅變化以提高透明樣品圖像對比度的一種光學顯微鏡。

       荷蘭物理學家Frits Zernike（弗里茨·澤爾尼克，1953年物理學諾獎獲得者）在20世紀30年代發(fā)明的相襯顯微技術(shù)，將倒置相差顯微鏡與細胞生物學實驗緊緊地聯(lián)系在一起。人們無需對樣品進行染色處理便可直接觀察活細胞形態(tài)特征、分裂和增殖的活動過程。相差顯微技術(shù)誕生后，配套環(huán)形光闌、相襯物鏡等光學元件的研究改進隨之展開，推動了倒置相差顯微鏡的廣泛應(yīng)用，極大地促進了生命科學的發(fā)展，具有劃時代的意義。

       半個多世紀以來，透射光相差分析被視為活細胞觀察的基礎(chǔ)和經(jīng)典方法。相應(yīng)地，透射光相差觀察功能不僅是Zeiss Primovert、Leica DMiL、Nikon ECLIPSE TS2、舜宇I(lǐng)CX41、Motic AE2000這類基礎(chǔ)型手動倒置相差顯微鏡的立命之本，相差觀察模式也是Axiovert 5 Digital、Leica Mateo FL、Invitrogen EVOS FLoid數(shù)字式倒置熒光顯微鏡，Zeiss Axio Observer 7、Leica DMi8與Olympus IXplore Pro（IX83）等具有多路光源輸入接口和圖像出口的研究級多功能電動倒置熒光顯微鏡，BZ-X810、Invitrogen EVOS F70000、APX10等新型一體式熒光顯微成像系統(tǒng)的基本功能選項。不僅如此，以高通量成像、3D細胞圖像渲染和多維度高內(nèi)涵圖像分析為核心任務(wù)的寬場式高內(nèi)涵、共聚焦式高內(nèi)涵分析系統(tǒng)，如ImageXpress Micro Confocal、ImageXpress Confocal HT.ai、Operetta CLS與Opera Phenix Plus，也可視實驗需要選配相差成像模塊，實現(xiàn)細胞相差、熒光相結(jié)合的多模式圖像疊加處理與分析。                                              

       倒置相差顯微鏡的功能設(shè)計和光路結(jié)構(gòu)相對簡單，既是新型相差技術(shù)引入應(yīng)用的先導(dǎo)平臺，同時也成為我們觀察活細胞相差觀察技術(shù)改良演變的微視場。而回顧經(jīng)典相襯顯微技術(shù)原理和實施要素，有助于更好地理解、探討當前相襯技術(shù)方法上創(chuàng)新嘗試及其理論淵源。

一、相差顯微技術(shù)的基本構(gòu)成要素

       光波在穿過非真空介質(zhì)時會產(chǎn)生振幅（即強度）和相位的變化。振幅變化通常是由于介質(zhì)對光的吸收，變化程度與波長（光的顏色）有關(guān)。

       人眼或光電傳感器能感知的是光波振幅和顏色的變化。物理學上將引起光波振幅變化的樣本或結(jié)構(gòu)稱為振幅體（amplitude objects）。染色的標本等振幅體內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)和區(qū)域光密度不一，光透射率不同，則透射光會出現(xiàn)強度和顏色的差異，從而為人眼所感知。

       而培養(yǎng)的哺乳動物細胞、原生動物、細菌、精子的尾等細胞或結(jié)構(gòu)完全透明。入射光與透射光間的強度變化微弱。此情況下采集的圖像上，細胞與培養(yǎng)基、細胞內(nèi)部細胞器間，明暗反差過小，難以清晰、完整地表征細胞的外形和內(nèi)部細節(jié)特征。

       然而，無論樣品是否完全透明, 因內(nèi)部構(gòu)造、組成成份、密度和折射率的不均衡，造成入射光的衍射、折射等傳播路徑改變和光程的不同。而光程變化使光波相位的不一致，既光產(chǎn)生了相移（phase shift）。這類在光線穿過時引起相移的標本或結(jié)構(gòu)稱為相位體（phase object)。相位體與透射光相互作用造成的光相位差異，為光波干涉的發(fā)生提供了基礎(chǔ)條件。

       光若毫無遮攔地前行穿透相位體薄層，則最終以接近直射的方式從樣品中射出。這部分光統(tǒng)稱為直射光（Direct light、surround light）或參考背景光。如光線在穿越樣品層中遇到樣品中細微差異性結(jié)構(gòu)（如細胞膜、細胞器等）干擾，發(fā)生衍射和散射，則統(tǒng)稱為衍射光（Diffracted light）。顯然，衍射光攜帶有與樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)差異有關(guān)的光相位信息。

       相襯顯微技術(shù)是根據(jù)惠更斯—菲涅耳原理，將非均一結(jié)構(gòu)與屬性相位體透射光中天然的衍射光和直射光分別提取，對光波振幅和(或)相位進行必要調(diào)制處理后重新復(fù)合，利用光干涉原理將光波的相位差異以光的明暗方式予以呈現(xiàn)。同時，利用相位與復(fù)合光波振幅二者的線性關(guān)系，將光波相干疊加形成的明暗分布與樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性聯(lián)系起來而創(chuàng)建圖像分析方法。這種基于透射光相位調(diào)制的成像方法稱為相襯對比法或相差法(Phase Contrast)。該技術(shù)是涵蓋從指導(dǎo)理論到實施方法的一套完整體系。它無需染色處理即可將透明樣品在鏡下展現(xiàn)出反差足夠、錯落有致的明暗分布，實現(xiàn)相位體內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息的可視化。

       F. Zernike的相差顯微技術(shù)的相差顯微技術(shù)的核心要素主要包括以下三個方面。

1、環(huán)形光闌（Annular diaphragm）

       環(huán)狀光闌是安裝于聚光器上透射光源與聚光鏡之間的聚光鏡轉(zhuǎn)盤（Condenser Disk）或相襯滑塊（Phase Slider or Light-Ring Slide）中圓盤狀照明調(diào)節(jié)元件。照明光線從盤面的透明圓環(huán)區(qū)射入后，聚光鏡將圓環(huán)形照明光焦聚投射到樣本上形成一實心光斑。與暗視野（Dark-Field, DF）觀察法的相同之處在于：照明光的大部分被環(huán)形光闌阻擋，僅允許透明圓環(huán)區(qū)的少量光線以小角度斜射在樣品上。不同點是相襯法需保留照明光源并用作參考光。照明光大致沿原入射方向（忽略在樣品薄層中光傳播方向因折射造成的輕微平移）穿透樣品直達物鏡，并被重新校正為平行光束抵達物鏡相位板的共軛區(qū)。一小部分照明光線與樣品中光學致密結(jié)構(gòu)（例如質(zhì)膜、細胞器等）相遇而發(fā)生衍射，產(chǎn)生約1/4λ的相移。

2、相位板（annular phase plate）

       相位板為相差物鏡專屬，固定安裝在物鏡后焦平面上，是相襯觀察的核心光學元件。

       F. Zernike的研究發(fā)現(xiàn)：將樣品衍射光與穿透樣品未發(fā)生衍射的參考光（直射光）相結(jié)合并發(fā)生相干作用方可觀察到樣品透射光振幅的差異；將參考光波相位提前1/4λ，使參考光與衍射光之間的的相位差增加至1/2λ時，產(chǎn)生相消干涉，可實現(xiàn)相干疊加波幅的最大化，相位體圖像的對比度最優(yōu)；因直射光強度遠大于衍射光的強度，須將直射光強度削弱到接近于衍射光的強度后，才會觀察到顯著明暗反差對比。

       直射光的相位調(diào)制和光強度削減，被視為相襯顯微技術(shù)所的兩個基本規(guī)則。而相位板正是據(jù)此原理設(shè)計的。

       相位板為圓盤式，采用了2個無色補償區(qū)（Complementary Area）夾1個深色環(huán)狀共扼區(qū)(Conjugate Area)的同心圓布局。

       共扼區(qū)：又稱相位環(huán)(Phase Ring)，為相位板上與環(huán)狀光闌對應(yīng)的深色圓環(huán)。表面鍍有光吸收薄膜（故外觀看顏色較深），可吸收大部分參考光，使參考光波振幅衰減至與衍射光振幅相當。此外，共軛區(qū)還鍍有相位膜，使參考光通過時相位提前1/4λ（共軛環(huán)區(qū)厚度薄于補償區(qū)）或延遲3/4λ（共軛環(huán)區(qū)厚度厚于補償區(qū)）。使得衍射光與參考光之間相位差達1/2λ而發(fā)生相消干涉，增強光波相干疊加振幅和相襯對比效果。

       補償區(qū)：相位板盤面共扼面之外的無色透明區(qū)域，用于透射來自樣品的衍射光。衍射光傳播方向呈360°發(fā)散狀態(tài)，為盡量多地收集衍射光以增強疊加波幅，故盤面的大部分面積都用作補償區(qū)。表面鍍膜易造成衍射光的損失，多數(shù)相位板為補償區(qū)無深色吸光介質(zhì)設(shè)計，外觀光潔透明。

(待續(xù)：3、環(huán)形光闌-相位板共軛)