（前續(xù)：Type 45Ti轉(zhuǎn)頭在蛋白分離中的應(yīng)用) 

二、Beckman Type 45Ti角轉(zhuǎn)頭在細(xì)胞外囊泡離心分離中的應(yīng)用

      在細(xì)胞外囊泡(EVs)離心分離應(yīng)用是近10年來Type 45Ti角轉(zhuǎn)頭有關(guān)高分實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)井噴的重要推手（有關(guān)技術(shù)問題可參考阿拉斯加科技發(fā)布的《外泌體超速離心分離法基礎(chǔ)操作流程1 (譯稿)》、《Optima MAX-XP臺式超速離心機(jī)在外泌體分離中應(yīng)用的主要類型》等文）。

      Type 45Ti角轉(zhuǎn)頭額定最高轉(zhuǎn)速45000rpm, 轉(zhuǎn)頭內(nèi)部RCFav 158000 ×g。其RCF指標(biāo)符合基礎(chǔ)操作流程1推薦RCF要求。而轉(zhuǎn)頭工作容量6×94mL, 離心處理樣品容量達(dá)420-550mL, 很好地適應(yīng)了培養(yǎng)基自帶外泌體顆粒排空所需的較大體積要求, 便于高效完成調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的準(zhǔn)備。

      EVs差速離心分離法, EVs回收率不高, 對起始樣品材料的體積有一定要求。而Type 45Ti轉(zhuǎn)頭單管容量大, 可同時勝任中大體積培養(yǎng)基樣品的高速、超速離心沉兩個環(huán)節(jié)的操作。

      此外, Type 45Ti轉(zhuǎn)頭通過添加相應(yīng)適配器后, 可兼容4-94mL容積范圍各種常用超速離心管, 可根據(jù)實(shí)際樣品體積大小和分離技術(shù)要求, 靈活選擇所需的超速離心管款式與規(guī)格。

      因此, 在以細(xì)胞培養(yǎng)基為初始樣品來源的細(xì)胞外囊泡, 主要是小細(xì)胞外囊泡——外泌體的提取分離中, 深受歡迎。我們通過兩個代表性實(shí)例來了解其使用方法。

實(shí)例1：巨噬細(xì)胞EVs炎癥控制功能研究（Tuan Anh Phu, 2023）

      巨噬細(xì)胞載脂蛋白E（apolipoprotein E, ApoE）的表達(dá)可以調(diào)節(jié)microRNA控制的NF-κB信號傳導(dǎo)通路, 被認(rèn)為在調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥和組織修復(fù)特性中起核心作用。而研究證實(shí), 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外囊泡(EVs)可以差異地控制受體細(xì)胞的炎癥特性。ApoE的表達(dá)與EVs介導(dǎo)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路之間的相互關(guān)系并不清除。

      通過源自對野生型小鼠骨髓的巨噬細(xì)胞（WT-BMDM）、ApoE缺陷型小鼠骨髓的巨噬細(xì)胞（EKO-BMDM）分布產(chǎn)生的兩種細(xì)胞外囊泡WT-BMDM-EV、EKO-BMDM -EV 的對比研究顯示：WT-BMDM-EV通過增加細(xì)胞 apoE 和 miR-146a-5p 水平, 從而減少 NF-κB 信號傳導(dǎo), 將抗炎特性傳達(dá)給受體骨髓細(xì)胞。同時, 還下調(diào)了受體骨髓細(xì)胞miR-142a-3p的水平而導(dǎo)致CPT1A水平升高, 改善受體細(xì)胞中的脂肪酸氧化（FAO）和氧化磷酸化（OxPHOS）。實(shí)驗(yàn)證實(shí), 將WT-BMDM-EV輸注到高脂血癥小鼠中可以解決炎癥。相比之下, EKO-BMDM-EV 通過降低 apoE 和 miR-146a-5p 的細(xì)胞水平發(fā)揮相反的作用, 增加 NF-κB 驅(qū)動的 GLUT1 介導(dǎo)的葡萄糖攝取、有氧糖酵解和氧化應(yīng)激。此外, EKO-BMDM-EV 增加了細(xì)胞 miR-142a-3p 水平, 從而降低了 CPT1A 水平并損害了受體髓系細(xì)胞中的 FAO和 OxPHOS, 傳達(dá)炎癥信號。高脂血癥小鼠輸注EKO-BMDM-EV治療會增加造血并驅(qū)動骨髓細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

      研究結(jié)果表明, apoE表達(dá)的喪失不會改變培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞分泌EVs的速率或大小, 但它會顯著影響其細(xì)胞信號傳導(dǎo)特性。巨噬細(xì)胞EVs免疫代謝調(diào)節(jié)特性具有Apo依賴性特征, 受EmiR-146a-5p和miR-142a-3p控制的轉(zhuǎn)錄軸。

      實(shí)驗(yàn)中巨噬細(xì)胞分泌的外泌體的分離和純化主要操作流程如下：

1）將BMDM以5×10⁶個細(xì)胞/板的密度接種到15cm平板中培養(yǎng)6-8天后, 在自帶EV耗盡的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基（經(jīng)Type 45 Ti轉(zhuǎn)頭100000×g超速離心18小時）中孵育24小時；

2）收集調(diào)節(jié)培養(yǎng)基, 4℃下以400×g離心10分鐘以沉淀死細(xì)胞和碎片, 然后在4℃下以2000×g離心20分鐘以消除碎片和較大的囊泡；

3）然后將上清液過濾（0.2μm）,添加于60%碘沙醇（iodixanol）緩沖液之下, 用Type 45 Ti轉(zhuǎn)頭以100000×g離心3小時, 收集沉淀；

4）重懸沉淀, 采用OptiPrep密度梯度液（5%, 10%, 20%w/v）在SW 40 Ti轉(zhuǎn)頭4℃下100000×g離心18小時進(jìn)一步分離純化EVs；

5）從管頂部開始收集不同密度餾分, 共獲得12個1mL 級分。將梯度餾分7在PBS中用Slide-A-Lyzer Mini透析裝置透析后, 用于后續(xù)細(xì)胞處理實(shí)驗(yàn)和EVs表征分析。

實(shí)例2：骨髓細(xì)胞EVs的CD8 + T細(xì)胞活化調(diào)節(jié)機(jī)制研究（Lisa Rausch, 2023）

      急性炎癥反應(yīng)中循環(huán)磷脂酰絲氨酸陽性細(xì)胞外囊泡（PS+ EVs）與體內(nèi)活化的CD8 + T細(xì)胞相互作用研究的動物實(shí)驗(yàn)中, 源自BMDC的EVs也采用了先Type 45角轉(zhuǎn)頭沉淀后水平轉(zhuǎn)頭密度梯度純化的操作流程：

純RPMI培養(yǎng)基以1：1比例與FCS混合后, 在4℃以100000×g離心18小時進(jìn)行EV排空處理, 0.2μm過濾上清后-20℃儲存?zhèn)溆茫?/span>

動物股骨和脛骨骨髓細(xì)胞以1×106 / mL的密度接種在RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天后, 用30 ng/mL LPS和2 μg/mL SIINFEKL肽刺激貼壁細(xì)胞72 h后, 從BMDC收集上清液（每次實(shí)驗(yàn)約70個T175瓶）；

2000×g離心20分鐘除去碎片；

上清用0.2μm濾膜過濾, 使用45Ti型固定角轉(zhuǎn)頭4℃下100000×g離心90分鐘；

將含EV的沉淀重懸于含有蛋白酶抑制劑的PBS中, 并使用Amicon離心柱濃縮。

洗滌后的EVs鋪墊在超透明離心管（344062）的底部；

用60%碘沙醇溶液覆蓋EVs液層, 另用PBS稀釋的30%碘沙醇覆蓋在60%濃度碘沙醇溶液之上, 最后用PBS覆蓋在離心管液體頂部, 完成不連續(xù)密度梯度溶液制備；

在SW 55 Ti水平轉(zhuǎn)頭中4℃下離心160000×g離心18小時；

從離心管梯度頂部收集每組餾分, 每種餾分各500μL。將餾分3至8合并后, 在Amicon離心柱中洗滌和濃縮；

納米顆粒跟蹤分析（NTA）測定EVs濃度后, 按2-7×10¹¹ EV劑量注射受試小鼠。

      上述兩項(xiàng)研究中, EVs分離的離心參數(shù)基本與“基礎(chǔ)操作流程1”基本一致, 不同之處有兩點(diǎn)。

      一是研究的內(nèi)容, 除EVs常規(guī)表征分析外, 引入了EVs動物體內(nèi)功能的驗(yàn)證分析。在第一輪超速離心沉淀完成后, 將第二輪洗滌EVs去除蛋白污染速的離心沉淀調(diào)整為碘沙醇密度梯度純化, 以減少沉淀物中蛋白、其它囊泡類污染組分對體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的干擾。

      二是第二輪外泌體純化操作的超速樣品管比“基礎(chǔ)操作流程1”常用的0.2-1.5mL微量管大。上述實(shí)例中, 同為從培養(yǎng)細(xì)胞分泌的EVs, 首次超速沉淀時單管體積均為94mL, 第二輪密度梯度離心所用轉(zhuǎn)頭是兩款工作容量不同的水平轉(zhuǎn)頭SW 40 Ti（6×14 mL）和SW 55 Ti（6×5.0 mL）。通常, 轉(zhuǎn)頭容量大, 密度梯度溶液可加載的EVs粗提物量更大, EVs最終產(chǎn)量大（SW 40 Ti采集的各餾分體積為1mL, 而SW 55 Ti產(chǎn)物體積為0.5mL）, 既方便分離后各餾分條帶回收操作, 又方便體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中EVs接種劑量的優(yōu)化調(diào)節(jié), 操作更為靈活。 

（后續(xù)：Type 45Ti轉(zhuǎn)頭在核糖體分離中的應(yīng)用）