Beckman Optima XPN 100/90/80、Optima XE 90/80立式超速離心機(jī)通用的Type 45 Ti鈦合金材質(zhì)定角轉(zhuǎn)頭，額定工作容量6×94mL，是除Type 19角轉(zhuǎn)頭（6×250mL，19000rpm）外，單管處理量最大的超速轉(zhuǎn)頭。其實驗應(yīng)用公開報道, 最早見于1978年澳大利亞費爾菲爾德傳染病醫(yī)院病毒研究人員從甲型肝炎患者糞便中分離甲肝病毒的實驗。
       截止至2023年9月30日, 從PubMed期刊數(shù)據(jù)庫中共采集到Beckman超速離心機(jī)Type 45Ti轉(zhuǎn)頭有關(guān)實驗文獻(xiàn)336篇。從論文發(fā)表時間看, 1978 - 2003年為轉(zhuǎn)頭應(yīng)用的低谷徘徊期, 2004年起，實驗應(yīng)用及產(chǎn)出進(jìn)入快速增長期。2004 - 2023這20年, 實驗論文數(shù)量出現(xiàn)指數(shù)級躍升。若以5年為一統(tǒng)計周期，則2019 - 2023年刊文數(shù)量是前40年論文總數(shù)的1.6倍之多（見圖1）。                                              

      尤其值得關(guān)注的是，2014-2023這10年總計有286篇研究報告發(fā)表。所發(fā)期刊的2023年IFoid 分值（參考https://sci.justscience.cn/查詢數(shù)據(jù)）8.0分以上者達(dá)117篇。其中，包括一大批在Nature、Cell、Science、Nat Methods、Cell Discov、Nat Microbiol和Protein Cell等期刊發(fā)表的高水平論文（見表1）。

表1.  Type 45Ti轉(zhuǎn)頭有關(guān)部分實驗應(yīng)用刊文統(tǒng)計（2019.01-2023.09）

       這其間高水平研究論文的占比之高，不免會引起人們的好奇與思考：如許之多有重大學(xué)術(shù)價值和廣泛影響力的研究項目中, 到底使用Type 45Ti轉(zhuǎn)頭分離何種實驗對象？

       對上述117個實驗報告的相關(guān)內(nèi)容歸類統(tǒng)計顯示：Type 45Ti轉(zhuǎn)頭的應(yīng)用對象主要包括蛋白質(zhì)（59例）、細(xì)胞外囊泡(EVs，44例) 和核糖體（8例）。此外，微粒體和脂質(zhì)等其它亞細(xì)胞組分、病毒類（慢病毒載體、甲病毒屬Getah病毒）應(yīng)用實例占比均低于2%(見圖2)。

      為此, 我們圍繞蛋白質(zhì)、細(xì)胞外囊泡(EVs)和核糖體分離有關(guān)應(yīng)用實例進(jìn)行了考察, 以了解超速離心機(jī)Type 45Ti角轉(zhuǎn)頭在其中所扮演的角色。

一、Type 45Ti轉(zhuǎn)頭在蛋白分離純化中的應(yīng)用

      與Beckman Type 45Ti轉(zhuǎn)頭應(yīng)用有關(guān)實例共計59例（BioRxiv平臺發(fā)表文章因IFloid無法查詢，不納入統(tǒng)計范圍）的蛋白研究存在多個維度。從蛋白在生命活動中的功能分，包括了細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運、微管運輸、胞內(nèi)囊泡生物發(fā)生及轉(zhuǎn)運、蛋白的翻譯-加工修飾-折疊及定位、蛋白復(fù)合體組裝及變構(gòu)、RNA轉(zhuǎn)錄和剪輯、DNA損傷修復(fù)和DNA轉(zhuǎn)座、細(xì)胞壁合成等細(xì)胞全流程生命活動。從蛋白分布定位看，有膜信號識別受體（如GPCRs）、ABC轉(zhuǎn)運蛋白，陽離子選擇性通道等各種膜離子轉(zhuǎn)運通道、核糖體新生鏈復(fù)合物（RNCs）等。

      雖然不同實驗所研究對象從真核生物（哺乳動物、果蠅）、原核生物（金黃色葡萄球菌、乳酸桿菌、恥垢分枝桿菌M. smegmatis等）、擬南芥、病毒（HIV-1, 噬菌體等）、螺旋體、瘧原蟲到DNA馬達(dá)各不相同，但研究思路、方法路線相似。無論是蛋白復(fù)合體組裝、配體-受體識別、蛋白與蛋白分子或蛋白-核酸結(jié)合、抗生素作用機(jī)制或細(xì)菌耐藥機(jī)制等，無不基于對蛋白分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)解析及與配體結(jié)合后構(gòu)象改變進(jìn)行的。統(tǒng)計顯示，上述59個研究項目中的36個項目的核心方法是用冷凍電鏡技術(shù)（Cryo-EM）對蛋白分子進(jìn)行了3D活性構(gòu)象的高分辨率分析。其余23個例是用X-ray晶體分析、電子顯微鏡技術(shù)、熒光偏振技術(shù)、單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移（single-molecule fluorescence resonance energy transfer，smFRET)技術(shù)等方法完成蛋白功能效應(yīng)與結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的分析（Structure-based mechanism）。

      蛋白組分制備技術(shù)有兩種途徑：一種是從豬腦、雞肝等動物組織器官中直接提取；第二種，也是最主要的途徑，是從細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞中的一種或兩種異源表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行分離純化。異源表達(dá)體系中使用最多的是原核表達(dá)系統(tǒng)是E. coli BL21 (DE3)，占比44%，沙門氏菌、乳酸桿菌用的較少。真核類表達(dá)系統(tǒng)中，昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)10例占比17%（依次是Sf9、Hi5和Sf21），其次是哺乳動物細(xì)胞中HEK293細(xì)胞系（10.1%）、酵母表達(dá)系統(tǒng)（8.5%）等。

1. 代表性蛋白研究應(yīng)用實例

實例1 膜蛋白（受體）的提?。↗oshua A. Lees, 2023）

      藥物作用靶向位點、細(xì)胞之間的信號傳遞，大多是通過生物膜上的特殊膜受體蛋白實現(xiàn)的。約50%臨床藥物的靶向分子為膜蛋白。生物膜上的受體蛋白的表達(dá)豐度一般較低，直接在天然生物環(huán)境中難以提取到足量蛋白。由于蛋白質(zhì)翻譯后還需經(jīng)過修飾包括糖基化，脂肪?；土姿峄刃揎棽拍苷_折疊、轉(zhuǎn)運以及與胞膜整合和定位。異源表達(dá)的受體蛋白或存在錯誤修飾、折疊導(dǎo)致而不具備生物活性，或表達(dá)效率不夠高效。此外，膜蛋白疏水性強(qiáng)，實驗條件下難以維持膜蛋白正確構(gòu)象，使得對膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的解析相對滯后。

      G 蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)是真核生物中最大的膜蛋白超家族，分為A類視紫紅質(zhì)樣受體（Rhodopsin-like receptor）、B 類分泌素受體家族（Secretin receptor family）、C類代謝型谷氨酸受體（mGlu receptor）、D 類真菌交配信息素受體（Fungal mating pheromone receptor）、E 類 cAMP環(huán)腺苷酸受體（Cyclic AMP receptor）和F類卷曲蛋白受體 (Frizzled receptor, FZD)六大類。GPCR是由7個跨膜螺旋、胞外N端、胞內(nèi)C端、3個胞外環(huán)和3個胞內(nèi)環(huán)的保守結(jié)構(gòu)組成。胞外區(qū)域在結(jié)合激動性信號分子(如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、趨化因子)后，受體構(gòu)象發(fā)生變化，受體胞內(nèi)區(qū)域招募并與G蛋白、P-arrestin等效應(yīng)蛋白、神經(jīng)遞質(zhì)以及激素等特異性配體結(jié)合，通過環(huán)腺苷酸(cAMP)信號通路、磷脂酰肌醇信號通路和鈣離子信號通路等調(diào)節(jié)體內(nèi)生理活動。

      孤兒受體（orphan GPCR，oGPCR）屬A類GPCR，因其內(nèi)源性配體尚未發(fā)現(xiàn)而得名。由于配體信息和配體結(jié)合靶點不明確，且孤兒受體與結(jié)構(gòu)已知GPCR同源程度較低，使得對孤兒受體的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能研究受阻。

      GPR61是一種與食欲相關(guān)的孤兒受體，是治療代謝和體重障礙的藥物靶標(biāo)。通過構(gòu)建N末端活性構(gòu)象（hGPR61-dnGαs/iN18）和非活性構(gòu)象（hGPR61ICL3BRIL）的重組蛋白進(jìn)行人GPR61的結(jié)構(gòu)表征，是對GPR61的選擇性小分子反向激動劑的結(jié)合位點和受體-配體相互作用方式研究的基礎(chǔ)。

      用于冷凍電鏡研究的孤兒受體GPR61構(gòu)建體表達(dá)蛋白的純化流程大致包括以下步驟：

【異源表達(dá)系統(tǒng)準(zhǔn)備】

人GPR61在活性構(gòu)象中的表達(dá)構(gòu)建體（hGPR61-dnGαs / iN18）和非活性構(gòu)象（hGPR61ICL3BRIL）的重組構(gòu)建體被轉(zhuǎn)化為DH10Bac E. coli感受態(tài)細(xì)胞以產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒DNA，將其轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲細(xì)胞中以產(chǎn)生P0病毒。通過在無血清昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基（SF-900 III）中以2×10⁶活細(xì)胞/ ml的密度和0.5的MOI感染1L的Sf-9細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。感染后當(dāng)細(xì)胞的活力為80-85%時收獲細(xì)胞。
【細(xì)胞膜制備】
收集培養(yǎng)的Sf-9細(xì)胞沉淀，在Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水中室溫孵育30分鐘，添加無EDTA的羅氏cOmplete蛋白酶抑制劑片劑后， 4℃下孵育30分鐘；
將細(xì)胞用高壓均質(zhì)機(jī)M-110L 15kPsi裂解細(xì)胞；
將細(xì)胞裂解物在Type 45 Ti角轉(zhuǎn)子中235000 ×g離心45分鐘，收集沉淀；
將沉淀重懸于500mM NaCl，50mM HEPES/pH 7.5中，添加無EDTA的Roche完全蛋白酶抑制劑片劑后重復(fù)上一步超速離心操作，收集沉淀；
【蛋白分離】
將沉淀重懸于含有150mM NaCl，50mM HEPES/pH 7.5,10%甘油的低鹽緩沖液中，添加無EDTA的Roche完全蛋白酶抑制劑片劑；
將粗膜提取液與1%月桂基麥芽糖新戊二醇（LMNG，Anatrace）和0.2%膽固醇半琥珀酸三鹽（CHS，Anatrace）溶解在500mM NaCl和50mM HEPES/pH 7.5,100μM TCEP中，添加無EDTA的Roche完全蛋白酶抑制劑片劑，孵育90分鐘；
【層析純化】
超速離心澄清裂解液，上樣值抗FLAG M2親和凝膠層析柱，4℃下孵育2小時；
用緩沖液（500mM NaCl，50mM HEPES/pH 7.5,100μM TCEP，0.5%LMNG和0.01%CHS）洗滌FLAG樹脂柱兩次；
使用緩沖液（0.25 mg/ml FLAG、0.01% LMNG、0.002% CHS、150mM NaCl、50mM HEPES/pH 7.5、100μM TCEP）洗脫；
將洗脫餾分合并，在離心過濾濃縮器中濃縮；
用含有0.001%LMNG，0.0002%CHS，150mM NaCl，25mM HEPES/pH 7.5,100μM TCEP的緩沖液在Superose 6尺寸排阻層析柱(SEC)上純化；
用SDS-PAGE分析餾分，收集合并單體GPR61對應(yīng)餾分。

實例2 從豬腦中純化動力蛋白激活蛋白(dynactin)（Sami Chaaban, 2022）

【組織準(zhǔn)備】
采集新鮮豬大腦，置于冰冷PBS中運輸；
將2個大腦（約200g）用冰冷PBS沖洗2遍，手動去除腦干和主要血管后，用HB緩沖液（35mM PIPES-KOH/pH 7.2, 1mM MgSO4, 0.2mM EGTA，0.1mM EDTA，1mM DTT）再次沖洗腦組織；
【組織裂解】
將大腦置于添加有3片無EDTA蛋白酶抑制劑片和1.3mM PMSF的230mL HB緩沖液中，用Waring均質(zhì)器以均質(zhì)15秒-停頓15秒的方式進(jìn)行4個循環(huán)裂解組織細(xì)胞；
裂解物用JLA-16.250高速角轉(zhuǎn)頭16000rpm離心15min；
【蛋白分離】
上清液用Type 45 Ti轉(zhuǎn)頭4℃下45000rpm離心50分鐘，棄沉淀；
【層析純化】
在玻璃纖維過濾器和0.45μm過濾器中過濾上清液后，加載到250mL SP-Sepharose強(qiáng)陽離子交換層析柱上。柱預(yù)先經(jīng)AKTA Pure SP緩沖液（35mM PIPES/pH 7.2, 5mM MgSO4, 1mM EGTA, 0.5mM EDTA, 1mM DTT, 0.1mM ATP）平衡；
用含3mM KCl的SP緩沖液洗滌色譜柱后，以3倍柱體積250mM KCl的線性梯度洗脫。收集15 mS/cm附近的峰并用0.22μm過濾器過濾；
濾液加至用MonoQ緩沖液（35mM PIPES, 5mM MgSO4, 100μM EGTA, 50μM EDTA, 1mM DTT, pH 7.2）預(yù)平衡的MonoQ 16/10強(qiáng)陰離子交換層析柱上。用MonoQ緩沖液洗柱后，先以1倍柱體積的150mM KCl的線性梯度洗脫，再以10倍柱體積的350mM KCl的線性梯度洗脫。將39 mS/cm附近的洗脫峰餾分合并濃縮至3 mg/mL；
洗脫液轉(zhuǎn)移至用添加有5mM DTT、0.1mM ATP的GF150緩沖液洗(25mM HEPES/pH 7.2, 150mM KCl, 1mM MgCl2)預(yù)平衡的TSKgel G4000SWXL凝膠過濾柱上，將114 mL處的峰合并濃縮至3 mg/mL，分成3μL等分，用液氮速凍后-80℃儲存。

實例3 金黃色葡萄球菌耐藥機(jī)制研究（J. Andrew N. Alexander, 2023）

      耐甲氧西林抗生素的金黃色葡萄球菌簡稱金葡菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)對絕大部分β-內(nèi)酰胺類(β-lactamase)抗生素具有耐藥性。耐藥機(jī)制由Bla基因調(diào)控系統(tǒng)（由編碼β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)構(gòu)基因BlaZ、啟動子調(diào)節(jié)基因BlaR1和轉(zhuǎn)錄抑制因子基因BlaⅠ組成）和MecA調(diào)控系統(tǒng)（由青霉素結(jié)合蛋白PBP2a的結(jié)構(gòu)基因MecA、上游啟動子調(diào)節(jié)基因MecR1和轉(zhuǎn)錄抑制因子基因MecⅠ組成）介導(dǎo)。兩套耐藥基因系統(tǒng)同源（BlaR1和MecR1基因序列35%一致；BlaI和MecI序列61%相同）, 且轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式相同。

      BlaR1和MecR1均為跨膜蛋白胞外部分為感受器結(jié)構(gòu)域, 含有青霉素結(jié)合位點。細(xì)胞內(nèi)為金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域, 具有裂解Blal及Mecl的功能。當(dāng)β-內(nèi)酰胺類抗生素等誘導(dǎo)劑結(jié)合到BlaR1的感受器結(jié)構(gòu)域, BlaR1被激活, 其胞內(nèi)鋅金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象改變, 水解抑制蛋白BlaⅠ水解并使之脫離BlaZ的啟動子結(jié)合位點, BlaZ基因轉(zhuǎn)錄抑制解除, 表達(dá)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶, 導(dǎo)致對β-內(nèi)酰胺類抗生素出現(xiàn)耐藥性。與此類似，MecI抑制因子通常結(jié)合在MecA基因的啟動子部位。在β-內(nèi)酰胺類藥物的作用下, MecR1被激活, 構(gòu)象改變, 誘導(dǎo)對MecⅠ蛋白水解并從啟動子上脫落, MecA基因得以表達(dá)合成β-內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶點——合蛋白(penicillin-binding protein, PBPs) PBP2a。因PBP2a與β-內(nèi)酰胺類抗生素親和力極低, 對β-內(nèi)酰胺類藥物不敏感。而其所具有PBPs的完成細(xì)菌細(xì)胞壁合成功能, 卻能確保在抗生素作用下細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性。

      Bla調(diào)控系統(tǒng)可以調(diào)控MecA基因的表達(dá), 并且可在數(shù)分鐘內(nèi)誘導(dǎo)PBP2a的產(chǎn)生。而MecA調(diào)控系統(tǒng)從激活到PBP2a合成則需要數(shù)小時之久。因此, Bla調(diào)控系統(tǒng)在許多MRSA菌株廣譜抗生素耐藥性方面作用至關(guān)重要。

      研究還發(fā)現(xiàn), BlaR1無需其他組分參與可直接自發(fā)切割BlaI（spontaneous autocleavage）啟動抗生素耐藥性機(jī)制。

      冷凍電鏡數(shù)據(jù)表明, 耐藥性BlaR1野生型與其F284A突變體（可有效結(jié)合β-內(nèi)酰胺類抗生素狀態(tài)）為異質(zhì)二聚體穿膜結(jié)構(gòu)。N端的鋅指金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域在胞內(nèi), C端的可結(jié)合β-內(nèi)酰胺的感受結(jié)構(gòu)域位于胞外側(cè)。兩個單體間通過胞質(zhì)側(cè)的α9螺旋結(jié)構(gòu)連接。胞外β-內(nèi)酰胺的感受結(jié)構(gòu)域與另一個單體胞外部分EL1相互作用。提示了BlaR1蛋白野生型胞外結(jié)構(gòu)域與β-內(nèi)酰胺類藥物抗生素間還存在活性位點競爭性排斥作用。

      研究表明, BlaR1中Ser283和Phe284間存在自切割環(huán)（autocleavage loop）, 這個曲環(huán)通常占據(jù)胞內(nèi)鋅金屬蛋白酶活性位點（F284A突變體中的自切環(huán)部位結(jié)構(gòu)完整, 而野生型結(jié)構(gòu)中該自切環(huán)存在未切割和切割兩種狀態(tài)）。自切割環(huán)卡位阻礙了鋅指金屬酶對BlaI、MecI轉(zhuǎn)錄抑制因子的水解, 而BlaI的二聚物狀態(tài)可穩(wěn)定結(jié)合在啟動子上。當(dāng)β-內(nèi)酰胺結(jié)合到BlaR1胞外側(cè)的感受結(jié)構(gòu)域時, 感受結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)酶活性結(jié)構(gòu)域均向細(xì)胞壁靠近和構(gòu)象的變化, 使自切環(huán)脫離鋅指蛋白酶活性位點。此活性位點的暴露方便了BlaI結(jié)合和水解, 耐藥基因表達(dá)抑制弱化, β-內(nèi)酰胺耐藥基因表達(dá)的增加，產(chǎn)生耐藥效應(yīng)。

      該研究項目中，針對β-內(nèi)酰胺類藥物受體蛋白BlaR1的cryo-EM分析和蛋白測序應(yīng)用，分別采用了兩種制備流程。

1）氨芐青霉素誘導(dǎo)下BlaR1構(gòu)象的cryo-EM分析

【菌體準(zhǔn)備】
4℃下離心收集菌體, 并重懸于添加了5mg/mL溶菌酶和20μg/mL DNase I的裂解緩沖液（150mM NaCl, 50mM HEPES/pH 7.5）中, 37℃攪拌、孵育1小時；
裂解液冰浴冷卻后，用高壓均質(zhì)器25000 psi下裂解菌體；
將裂解物以18600×g離心30分鐘；
【細(xì)胞膜制備】
上清液用Type 45 Ti角轉(zhuǎn)頭4℃、40000rpm離心1小時, 棄上清收集沉淀；
【膜蛋白分離】
用Dounce均質(zhì)器將膜沉淀重懸于添加1%（w/v）DDM的裂解緩沖液中，孵育1小時以提取膜；
用Type 45 Ti角轉(zhuǎn)頭4℃、40000rpm離心45 min后, 棄沉淀（不溶膜組分），收集上清；
上清經(jīng)0.45μm濾膜過濾后, 添加咪唑至濃度20 mM/pH 7.5；
【層析純化】
裝入經(jīng)平衡緩沖液處理的His-Trap HP層析柱中，分別用15mL的20mM、100mM咪唑緩沖液A各洗滌一次后, 用325 mM咪唑緩沖液A進(jìn)行洗脫；
洗脫餾分用填充Sephadex G-25脫鹽柱在緩沖液A中進(jìn)行脫鹽處理；
用離心濃縮器（100 kDa NMWL）濃縮；
【氨芐青霉素誘導(dǎo)變構(gòu)處理】
用BioComp梯度大師配制輕重兩組甘油梯度緩沖液：輕緩沖液組成包括5%（v/v）甘油, 150mM NaCl, 20mM HEPES/pH 7.5加或不加0.01% LMNG洗滌劑；重甘油梯度緩沖液組成包括 25%（v/v）甘油, 150mM NaCl, 20mM HEPES/pH 7.5；
對于氨芐青霉素處理樣品, 將BlaR1（F284A）在1 mM氨芐青霉素冰上孵育約15 min, 然后用250μM氨芐西林制備所有后續(xù)緩沖液；
將150-250μL的蛋白質(zhì)樣品添加于甘油梯度層上, 用SW 55 Ti水平轉(zhuǎn)頭4℃、55000 rpm離心8小時，用BioComp梯度分餾儀收集梯度餾分；
各餾分用Amicon Ultra (100?kDa NMWL)過濾器4℃下6000×g濃縮；
濃縮后蛋白組分收集于緩沖B（150?mM NaCl, 20?mM HEPES/pH?7.5）中, 用Micro Bio-Spin P-30進(jìn)行脫鹽處理。

2）BlaR1自切割環(huán)位點Edmann端測序用BlaI蛋白純化
【異源表達(dá)系統(tǒng)準(zhǔn)備】
將一個BlaI-麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）融合結(jié)構(gòu)克隆到BlaI的C端, 并具有Gly-Ser-Ser連接子。N-端用10xHis 標(biāo)簽設(shè)計BlaI-MBP結(jié)構(gòu), 克隆到pGEX-6P-1表達(dá)質(zhì)粒中, 并轉(zhuǎn)化大腸桿菌（DE3）細(xì)胞。DE細(xì)胞在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約0.6 - 0.8時，用IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)蛋白并將培養(yǎng)溫度降低至20℃，過夜后收集菌體；
菌體在緩沖液3A（25mM Tris/pH 8.0和100mM NaCl）中裂解；
【膜蛋白分離】
細(xì)胞裂解液用Type 45 Ti轉(zhuǎn)頭4℃、40000rpm離心45 min；
【層析純化】
上清用0.45μm過濾器過濾后,添加咪唑至10mM濃度, 轉(zhuǎn)移至經(jīng)緩沖液3A中平衡的1mL His-Trap HP親和層析柱；
用10倍柱體積、濃度2%的緩沖液3B(50?mM Tris/pH?8.0, 500?mM imidazole, 100?mM NaCl）洗柱后, 以1ml/min流速用0-100%梯度洗脫；
洗脫組分用Amicon Ultra（30 kDa NMWL）的離心過濾器濃縮；
上樣至經(jīng)緩沖液3C（25mM Tris/pH 8.0,100mM NaCl）平衡處理的Superdex 75 10/300凝膠層析柱完成蛋白純化。

2. 蛋白分離中Type 45 Ti的應(yīng)用優(yōu)勢

       資料顯示，超速離心是保持蛋白活性構(gòu)象提取分離的必由之路。從操作流程上看, 無論取材于天然組織，或源于異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的重組蛋白，初始組織勻漿、細(xì)胞裂解液體積往往較大。對于疏水性的膜蛋白組分，往往需經(jīng)歷大容量低速離心收集細(xì)胞—細(xì)胞裂解液高速離心澄清—裂解上清或沉淀重懸液的超速離心分離的過程。而MBP融合蛋白、dynactin等可溶性蛋白組分，大體積裂解液直接上樣到Type 45 Ti轉(zhuǎn)頭，只需一步操作即可將蛋白與EVs、細(xì)胞器和細(xì)胞碎片分離，獲得蛋白的粗提溶液。因此，Type 45 Ti角轉(zhuǎn)頭超速離心功能和較大的容量，正好可以大有作為。
        不同蛋白理化屬性、下游應(yīng)用（如cryo-EM分析與Edmann測序分析）對樣品品質(zhì)要求雖有不同，但對于提取緩沖液，首先用Type 45Ti角轉(zhuǎn)頭超速離心沉淀處理是一致的基礎(chǔ)步驟。與核糖體、病毒類樣品分離不同，密度梯度離心環(huán)節(jié)在蛋白的提取分離中并非必須步驟。
        統(tǒng)計表明, 同時使用角轉(zhuǎn)頭沉淀、水平轉(zhuǎn)頭密度梯度離心兩步分離的報道實例占比約1/3。先用單管容量較大的Type 45Ti角轉(zhuǎn)頭將可提取溶液上清中蛋白組分沉淀，再將沉淀轉(zhuǎn)移至容量相對較小的水平轉(zhuǎn)頭進(jìn)行密度梯度分級。水平轉(zhuǎn)頭中，最常用的是容量6×38.5mL的SW 28或SW 32 Ti, 其次是容量6×13.2mL的SW 41 Ti、SW 40 Ti 或SW 32.1 Ti (6×17mL)。用容量較小的SW 60 Ti (6×4.0mL)進(jìn)行純化也有報道。蛋白組分密度梯度離心使用較多的梯度介質(zhì)是蔗糖。密度梯度離心耗時往往長達(dá)15-18小時, 對實驗操作、工作效率都是一種挑戰(zhàn)。因此，大多數(shù)報道實例中，采用的是2-3種蛋白層析柱組合的辦法取代密度梯度離心實施提取液中蛋白的純化分離。 

（后續(xù)：Type 45Ti角轉(zhuǎn)頭在細(xì)胞外囊泡離心分離中的應(yīng)用）