目前全球廣泛使用的外泌體超速離心(differential centrifugation, DC)分離法基礎(chǔ)操作流程，源于法國(guó)居里研究所G. Raposo、A. Clayton等2006 年發(fā)表的《Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids》。文中詳細(xì)描述了從細(xì)胞培養(yǎng)上清液和生物體液中分離外泌體的 基礎(chǔ)操作流程1（參考《外泌體超速離心分離法基礎(chǔ)操作流程1 (譯稿)》）。
        基礎(chǔ)操作流程1給出的超速離心全過(guò)程主要分為三個(gè)步驟：

步驟1：連續(xù)4℃低速(300×g，10分鐘)、中速(2000×g，20分鐘)離心，依次除去活細(xì)胞、死細(xì)胞碎片及樣品中的其它有形細(xì)小顆粒；

步驟2：4℃下10000×g離心去除體積較大的微囊泡及凋亡小體;

步驟3：4℃下100000×g離心沉淀外泌體組分并除去與之共沉淀的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。

       實(shí)際應(yīng)用中，因初始提取樣品材料類(lèi)型、體積不同，加之不同實(shí)驗(yàn)條件不一，樣品的高速離心處理環(huán)節(jié)，具體細(xì)節(jié)往往存在差異。在此，我們對(duì)基礎(chǔ)流程1中超速分離前的低溫離心流程綜合考慮，對(duì)其中所需的離心機(jī)性能和轉(zhuǎn)頭配置要求加以探討。

       ISEV調(diào)查結(jié)果顯示，分離EVs所用初始樣品中，血漿體積通常在5mL以?xún)?nèi)，尿液為5-100mL，有25%受訪(fǎng)者實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞培養(yǎng)基>100mL，所用培養(yǎng)基體積5-100mL的實(shí)驗(yàn)近50%，腦脊液和牛奶起始體積5-100mL，來(lái)自復(fù)雜基質(zhì)樣品、非哺乳動(dòng)物來(lái)源的樣品體積少于1mL。

       對(duì)起始材料離心，既要保證效率又要避免材料在離心容器中的損失和污染，則低溫離心機(jī)配置應(yīng)滿(mǎn)足以下要求。

1. 單管容量

       單管容量應(yīng)覆蓋1.5mL – 100mL范圍，以1.5mL – 250mL范圍最佳。其中應(yīng)包括1.5mL、10mL圓底管、15mL尖底管、50mL尖底管、100mL圓底管、200mL尖底管和250平底離心管/瓶配套適配器和（或）輔助墊片附件。

2. 轉(zhuǎn)頭配置

       10 - 250mL容量離心管/瓶用于2000×g以下低速離心沉淀細(xì)胞和微小顆粒；

       1.5– 50mL高速角轉(zhuǎn)頭用于10000×g-20000×g階段大囊泡、凋亡小體的沉淀。

       考慮到尖底離心管、錐形離心瓶生成沉淀后轉(zhuǎn)移上清操作的便利，高速角轉(zhuǎn)頭中可優(yōu)先考慮能直接離心15mL/50mL尖底管的高速角轉(zhuǎn)頭，如Beckman JA-12尖底管角轉(zhuǎn)頭（12×50mL/12000rpm/23200×g)、Thermo F15-8×50cy（8×50mL錐形管/ 14500rpm/RCF 24446×g）、F13-14×50cy（14×50mL錐形管/10000rpm/RCF 17105×g）。其次是50-100圓底管高速角轉(zhuǎn)頭，如Thermo F15-6×100y轉(zhuǎn)頭(6×100mL/15000rpm/RCF 24652xg)、Highconic II角轉(zhuǎn)頭(6×94mL/10350rpm/RCF 15090×g，PN75003620)、eppendorf F-34-6-38角轉(zhuǎn)頭（6×85mL /11000rpm/RCF 15550×g）、Beckman JA-18(10×100mL /18000rpm/47900×g)、JA-25.50(8×50mL/25000rpm/75600×g）和S-13.1高速水平轉(zhuǎn)頭（6×50mL/13000rpm/RCF26500×g）。

       須注意：外泌體分離流程中所需的RCF值應(yīng)理解為轉(zhuǎn)頭平均半徑處RCF_av，而非產(chǎn)品資料中標(biāo)示的該轉(zhuǎn)頭在最高轉(zhuǎn)速下產(chǎn)生的最大RCF_max。因此，凡轉(zhuǎn)頭標(biāo)示最大RCF為10000 - 12000×g角轉(zhuǎn)頭、水平轉(zhuǎn)頭，如其RCF_av根本無(wú)法達(dá)到10000×g離心要求。

       以圖中Beckman S40410水平轉(zhuǎn)頭為例，額定最高轉(zhuǎn)速10000rpm時(shí)，轉(zhuǎn)頭最大離心力為10733×g，但此時(shí)轉(zhuǎn)頭內(nèi)部的平均離心力僅為6826×g。Thermo HighConic III 錐形管角轉(zhuǎn)頭（最高轉(zhuǎn)速9500rpm/RCFmax 12108×g）、Allegra X-30R使用F0685定角轉(zhuǎn)頭(6×85mL/最高10000rpm/RCFmax 10864×g)都存在相同現(xiàn)象。

3. 離心機(jī)機(jī)型

       既滿(mǎn)足300×g - 2000×g離心，又能適應(yīng)10000×g高速沉降要求的低溫離心機(jī)，可首選相對(duì)經(jīng)濟(jì)的中等容量臺(tái)式低溫高速離心機(jī)，如Thermo Multifuge X1R Pro、Sorvall ST1R Plus、eppendorf 5804R等。

       實(shí)驗(yàn)條件許可， Beckman Avanti J-E、Avanti J-26 XP、Avanti JXN-26和Avanti JXN-30及Himac CR -22N等立式低溫高速離心機(jī)亦無(wú)不妥。如3.1.1.4 培養(yǎng)細(xì)胞外泌體結(jié)構(gòu)與質(zhì)譜分析項(xiàng)目中，用到Beckman Avanti J-J26XP立式低溫高速離心機(jī)JA 25.15高速角轉(zhuǎn)頭（25000rpm/24×15mL)對(duì)去除細(xì)胞碎片后的上清12500×g、40 min、4℃離心去除體積較大的mEVs、lEVs后再進(jìn)行超速沉降外泌體。