iBright FL1500 藍(lán)綠透射光源的檢測(cè)應(yīng)用

       Western Blot熒光成像分析儀的江湖上，伯樂ChemiDoc MP、GE Amersham ImageQuant 800 Fluor（AI800 Fluor）、耶拿UVP ChemStudio Plus和賽默飛Invitrogen iBright FL1500這四雄，要論硬件配置上最顯著的區(qū)別，恐怕是非透射光源（Transilluminator）莫屬。因?yàn)?，伯樂、UVP的系統(tǒng)用了經(jīng)典302nm的透射紫外臺(tái)（Trans-UV）；AI800 Fluor默認(rèn)裝備是LED透射白光（LED trans-white），當(dāng)然可以選配AI800 UV升級(jí)模塊；而iBright FL1500標(biāo)配是一臺(tái)LED藍(lán)綠光透射儀（green-LED transilluminator）。

       很明顯，GE主打Western+蛋白凝膠圖像分析，Bio-Rad和UVP是要兼顧核酸、蛋白凝膠成像需求，而Thermo Fisher則意圖實(shí)現(xiàn)凝膠類等透明樣品的激發(fā)、照明多樣化檢測(cè)。那iBright FL1500的這一設(shè)計(jì)究竟是銳意創(chuàng)新的結(jié)晶，還是嘩眾取寵的敗筆？這一問題值得探討。

一、透射藍(lán)綠色光源在核酸凝膠檢測(cè)中應(yīng)用的表現(xiàn)

       根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和廠商使用說明，對(duì)4大類核酸常用熒光染料標(biāo)記凝膠成像激發(fā)方案匯總后，可獲得表1所列信息。

表1 常見核酸熒光染料激發(fā)波長(zhǎng)列表

       科研實(shí)驗(yàn)中不少熒光試劑，在紫外、藍(lán)光波長(zhǎng)下都有強(qiáng)度不等的吸收峰。理論上，可使用其中任何一種光源激發(fā)。

       以溴化乙錠（EB）為例，它的激發(fā)峰有兩個(gè)：波長(zhǎng)300 nm最大激發(fā)峰（主激發(fā)峰）和波長(zhǎng)518nm次激發(fā)峰，次激發(fā)峰強(qiáng)度明顯低于紫外波長(zhǎng)激發(fā)峰。藍(lán)綠光透射儀雖然可以有效激發(fā)EB，而且經(jīng)1.25kb基因擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠成像對(duì)比證明，用302nm紫外光透射儀激發(fā)和基于iBright FL1500 Western成像分析儀檢測(cè)，所獲凝膠圖像效果極其接近。                                              

       廠商發(fā)布的熒光染料技術(shù)資料中推薦的激發(fā)波長(zhǎng)，素有主激發(fā)峰波長(zhǎng)、可用激發(fā)波長(zhǎng)(次激發(fā)波長(zhǎng))之分。在主、次激發(fā)波長(zhǎng)的條件下，熒光基團(tuán)發(fā)光強(qiáng)度有差異，使得相同曝光時(shí)間內(nèi)，凝膠的中、低豐度樣品條帶的圖像信號(hào)表現(xiàn)可能不一致。若成像條件未經(jīng)優(yōu)化，為強(qiáng)化弱信號(hào)條帶檢測(cè)而延長(zhǎng)曝光時(shí)間，不僅會(huì)引入更多圖像背景噪音成份，還可能造成強(qiáng)信號(hào)條帶過飽和，高中低信號(hào)條帶強(qiáng)度對(duì)比失真。而基于過度曝光的圖像信號(hào)定量條帶樣品含量，不符合ImageJ指南關(guān)于圖像分析中運(yùn)用朗伯-比爾定律的條件。

       一般情況下，采用熒光試劑最大激發(fā)峰波長(zhǎng)檢測(cè)，具有更好信噪比，有助于提高檢測(cè)靈敏度。因此，樣品豐度的定量分析應(yīng)基于染料的主激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)定，而定性分析（如樣品分子量對(duì)比鑒定）可以采用次激發(fā)波長(zhǎng)檢測(cè)。

       整體上，波長(zhǎng)490-520 nm藍(lán)綠光透射儀與凝膠成像分析儀標(biāo)配302nm透射儀（波長(zhǎng)范圍280–320nm，輻射能量峰波長(zhǎng)302nm），二者可激發(fā)的熒光染料種類基本重疊。

       對(duì)兩種文獻(xiàn)報(bào)道中常用的核酸相對(duì)定量分析染料SYBR Gold、SYBR Green的激發(fā)效果，藍(lán)綠色激發(fā)光顯然更優(yōu)。而302nm紫外則最適于溴化乙錠EB、GelRed 和GelSafe的檢測(cè)。

       Gel Safe類核酸安全無毒染料，雖兼容藍(lán)光、紫外兩種激發(fā)波長(zhǎng)，但基因克隆實(shí)驗(yàn)中，藍(lán)綠光照射可避免凝膠觀察和切膠過程中，人體和樣品的紫外線暴露損傷風(fēng)險(xiǎn)。故GelRed、GelSafe等染料在實(shí)際使用中，更多的是基于藍(lán)綠光而非紫外線來檢測(cè)。何況，LED光源使用壽命比紫外燈長(zhǎng)，無須定期更換，節(jié)省管理維護(hù)成本。

       因此，核酸凝膠檢測(cè)應(yīng)用，iBright FL1500的490-520nm波長(zhǎng)透射儀配置方案要優(yōu)于常規(guī)紫外透射儀。

二、藍(lán)綠色透射儀在蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用

       生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中蛋白樣品類型多樣，手工和預(yù)制SDS-PAGE凝膠，常規(guī)免染型凝膠和基因克隆平板都是常用樣品。

       蛋白免染凝膠熒光的應(yīng)用，iBright FL1500熒光成像儀不支持伯樂的蛋白免染凝膠檢測(cè)，只能使用英捷免染熒光試劑。這一點(diǎn)在《英捷iBright FL1500 Western熒光成像分析儀技術(shù)特點(diǎn)解析-2》已有討論。

       有文獻(xiàn)報(bào)道了用iBright FL1500 的LED藍(lán)綠光透射儀從底部照射搭載有GFP基因的克隆培養(yǎng)板，對(duì)靶蛋白表達(dá)克隆進(jìn)行快速篩查和克隆熒光計(jì)數(shù)分析。

表2  透射藍(lán)光與302nm紫外激發(fā)的蛋白凝膠熒光染料對(duì)比表

       表2數(shù)據(jù)顯示：蛋白凝膠熒光檢測(cè)應(yīng)用，490-520nm藍(lán)綠光和302nm透射儀的適用性各有千秋。用于凝膠總蛋白、翻譯后修飾蛋白的定量分析的常用熒光染料檢測(cè)的支持方面，兩種透射光源都存在短板，難以有效覆蓋全部應(yīng)用。相對(duì)而言，透射藍(lán)綠光源的兼容性更好。

       這給了我們一個(gè)有益的啟示：在考慮蛋白凝膠成像分析系統(tǒng)配置中，如有可能，應(yīng)將紫外、藍(lán)光兩種透射光源相結(jié)合，可極大提升系統(tǒng)蛋白凝膠檢測(cè)應(yīng)用的靈活性。

       iBright FL1500只能裝配藍(lán)綠透射儀，無紫透射外臺(tái)可供升級(jí)。而ChemiDoc MP、UVP ChemStudio Plus可以在標(biāo)配基礎(chǔ)上加配藍(lán)光屏或LED透射藍(lán)光臺(tái)（trans-blue）,通過搭配，兩種檢測(cè)光源取長(zhǎng)補(bǔ)短，相得益彰，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)功能擴(kuò)展的自由。

三、小結(jié)

       作為一款主要定位于Western blot實(shí)驗(yàn)印跡熒光、化學(xué)發(fā)光ECL檢測(cè)的高端成像分析儀， Invitrogen iBright FL1500通過引入藍(lán)綠透射光源和白光板這套配置，實(shí)現(xiàn)了對(duì)核酸凝膠、蛋白凝膠的熒光、可見光檢測(cè)分析的有效兼顧，從技術(shù)層面來說無疑非常成功。

       正所謂尺有所短寸有所長(zhǎng)，iBright FL1500不可能是完美無缺的杰作。

       首先，在核酸凝膠檢測(cè)上，由于官方只證實(shí)藍(lán)綠透射儀可以有效支持EB標(biāo)記染料的成像分析，但缺少EB染料標(biāo)記核酸定量檢測(cè)動(dòng)態(tài)線性范圍，以及這一線性范圍與基于標(biāo)準(zhǔn)302nm波長(zhǎng)檢測(cè)條件下動(dòng)態(tài)范圍的對(duì)比數(shù)據(jù)。當(dāng)用于高濃度的核酸樣品（如PCR擴(kuò)增產(chǎn)物）、低豐度樣品（低表達(dá)mRNA）和稀有珍貴樣品的定量分析時(shí)，若無相應(yīng)驗(yàn)證過程，則數(shù)據(jù)可靠性難免存疑。

       其次，在蛋白凝膠檢測(cè)上，iBright FL1500藍(lán)光透射儀可支持總蛋白檢測(cè)、修飾后蛋白檢測(cè)，但依然存在對(duì)Oriole (總蛋白檢測(cè)) 、Pro-Q Emerald 300 (糖基化蛋白檢測(cè))等染料不兼容的問題。

       此外，不支持已廣泛應(yīng)用的伯樂免染凝膠熒光的檢測(cè)。

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