讓ImageJ在Western Blot圖像分析中綻放-9

       曾有Photoshop培訓(xùn)師課堂提過，將圖像以90°或90°的整數(shù)倍數(shù)進(jìn)行圖像的旋轉(zhuǎn)、水平翻轉(zhuǎn)、垂直翻轉(zhuǎn)后，對圖像無損。但若以其他角度旋轉(zhuǎn)，則會損害圖像品質(zhì)。
       無論Photoshop還是ImageJ等專業(yè)圖像軟件，自帶Image Enhancement工具，可實施圖像的Adjustment, Rotate（旋轉(zhuǎn)）, Flip(對稱翻轉(zhuǎn))，Resize（大小縮放）等多種調(diào)整操作。軟件是通過不同圖像插值算法（可簡單理解為對原圖像中所有像素通過某種算法模型計算，按計算結(jié)果為新像素賦值的方法，對圖像像素重新布局的方法），對全部像素進(jìn)行了 “異地搬遷重建”,會不同程度損害圖像質(zhì)量，如圖像邊緣銳度和圖像像素強(qiáng)度。
       Western Blot實驗中，會經(jīng)常出現(xiàn)條帶排列位置傾斜的現(xiàn)象。在WB條帶蛋白定量分析時，對圖像旋轉(zhuǎn)修正，是否會影響條帶的分析值？條帶圖像傾斜有何建議和防范對策？   

一、實測ImageJ對Western Blot圖像旋轉(zhuǎn)對條帶的影響

1.1 圖像來源：詳見《在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應(yīng)用實測》相關(guān)內(nèi)容。
1.2 圖像準(zhǔn)備：將Clarity Max.tif用ImageJ軟件中【Image】→【Transform】→【Rotate】菜單命令，選擇雙立方插值（bicubic）設(shè)置，按+1.6°、-3.6°和-10°旋轉(zhuǎn)圖片后，分別保存為Clarity Max-Rotate 16.tif，Clarity Max-Rotate 36，Clarity Max-Rotate 100.tif備用。
1.3 選取各組中的條帶3，分別構(gòu)建3個分析選區(qū)。
       以條帶3中軸線和中心為參照，如圖1-1所示，采集圖像不同部位代表高、中、低信號強(qiáng)度的像素，按《ImageJ創(chuàng)建Western Blot條帶分析選區(qū)的基本規(guī)則》方法統(tǒng)計這些單像素選區(qū)的圖像灰度值。

表1  旋轉(zhuǎn)前后條帶的像素點圖像灰度值測試結(jié)果

       表1數(shù)據(jù)顯示：
      1）同一個條帶上相同位置像素，旋轉(zhuǎn)到新坐標(biāo)點重構(gòu)后，各像素強(qiáng)度值的還原程度不一。1.6°旋轉(zhuǎn)組與原圖組的測試數(shù)值接近或相同，而3.6°組和10°組數(shù)值存在較大誤差，尤以10°組誤差為甚；
      2）旋轉(zhuǎn)重構(gòu)誤差效應(yīng)在圖像中強(qiáng)、中等、弱信號像素群都存在。
      調(diào)用【Plot Profile】分析模塊，對3個旋轉(zhuǎn)組進(jìn)行Plot分析，結(jié)果見Fig 1-2。
 

       圖1-2顯示，隨著圖像旋轉(zhuǎn)角度從1.6°、3.6°加大10°，選區(qū)圖像信號強(qiáng)度分布形態(tài)發(fā)生改變。
      1）峰值從原圖的142.6變?yōu)?42.7，139.2和130，變化幅度隨著旋轉(zhuǎn)角度加大而加大。同時，峰頂由偏態(tài)過渡至對稱狀態(tài)，最后出現(xiàn)鈍化呈現(xiàn)偏態(tài)有調(diào)整跡象；
      2）峰的一側(cè)曲線末段走勢轉(zhuǎn)平緩，圖像強(qiáng)度值升高；
      3）選區(qū)范圍增大，選區(qū)寬度從最初13個像素擴(kuò)充為14個像素。
      4）旋轉(zhuǎn)后，條帶主體部分的面積變化不顯著，但選區(qū)左右兩側(cè)像亮度較低區(qū)域形狀、面積都有明顯不同。同時，選區(qū)右下角的強(qiáng)背景干擾區(qū)與選框相對位置發(fā)生變化。
      在條帶3的Plot Profile分析結(jié)果觀察到的現(xiàn)象，還重復(fù)發(fā)生在同組的其他條帶上（見Fig.1-3和Fig. 1-4）。

      各組間條帶5選區(qū)范圍一致，但峰值、峰頂行轉(zhuǎn)有所區(qū)別，同樣可見一側(cè)曲線末段斜率增大現(xiàn)象。

      各組間條帶9選區(qū)分布范圍、峰值和峰頂均有明顯變化，一側(cè)曲線邊緣部分斜率增大。
      Plot Profile分析表明，將Western Blot條帶圖像以小小角度旋轉(zhuǎn)，等于條帶經(jīng)歷了一場變革：
      1）旋轉(zhuǎn)重構(gòu)像素值的誤差，不僅改變了條帶主體的像素強(qiáng)度信號，也改變了條帶周圍圖像背景像素群的信號分布。條帶還是那個條帶，但選區(qū)分析的目標(biāo)像素群則已物是人非；
      2）構(gòu)成條帶的主體部分，作為選區(qū)內(nèi)圖像強(qiáng)度值最高的像素群，原來高度集中分布在有限的幾個像素列。旋轉(zhuǎn)后的條帶從豎直或接近豎直狀態(tài)逐漸傾斜，使高強(qiáng)度信號像素由中軸線向條帶兩側(cè)水平分散，使條帶峰值下降，峰頂外形（峰值、峰度、偏度）轉(zhuǎn)變。同時，還造成條帶邊緣部分像素列信號強(qiáng)度增強(qiáng)，以及弱信號條帶信號分布范圍的擴(kuò)張；
      3）條帶旋轉(zhuǎn)改變了圖像強(qiáng)背景信號團(tuán)塊與條帶邊緣部分的接觸狀態(tài)，部分弱信號像素得以在Plot Profile圖中被“激活”而“歸隊入列”；同時，條帶邊緣弱信號像素因陷入圖像背景包圍而被排除出選框。不同旋轉(zhuǎn)狀態(tài)，使選區(qū)內(nèi)有效檢測信號像素群的“純潔度”有了差異。

二、圖像旋轉(zhuǎn)對Western Blot條帶選區(qū)統(tǒng)計分析值的影響
2.1 ROI建立
      參考《如何用ImageJ為Western Blot條帶定量建立分析選區(qū)》的方法，分別為Clarity Max組、Clarity Max-Rotate 16組和Clarity Max-Rotate 36三組圖像全部條帶創(chuàng)建ROI。按《Western Blot條帶分析中如何計算ImageJ的滾球半徑？》介紹方法，核實ROI選區(qū)背景扣除滾球半徑，采用《在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應(yīng)用實測-上》相同背景扣除設(shè)置選項條件和統(tǒng)計值處理流程。觀察旋轉(zhuǎn)前后各組條帶選區(qū)分析值的變化。

2.2選區(qū)初始值統(tǒng)計結(jié)果

表2  組間選區(qū)圖像初始值表

      表1數(shù)據(jù)顯示，原圖、順時針旋轉(zhuǎn)1.6°和逆時針旋轉(zhuǎn)3.6°三個組各選區(qū)Area、Mean、Min、Max、IntDen均出現(xiàn)不同程度的變化。其中：
      Max值變化，提示條帶信號最強(qiáng)部分像素的強(qiáng)度值旋轉(zhuǎn)后沒有完全復(fù)原；
      Mean值變化，提示條帶整體亮度發(fā)生改變；
      Area值改變，說明旋轉(zhuǎn)后條帶信號強(qiáng)度分布范圍出現(xiàn)變化。
      將各組的測試值與同組內(nèi)測試值相對穩(wěn)定的條帶4測試值的比值，繪制成散點圖見Fig.2-1。

      圖2-1顯示，與各組圖像初始IntDen比值的差異比，校正背景后組間差異被明顯放大。整體上看，原圖組與旋轉(zhuǎn)1.6°組的曲線軌跡較一致；而3.6°旋轉(zhuǎn)組的曲線走勢差別明顯，這或許與組中條帶3、7、8、9測試值的劇變有關(guān)。

      圖2-2顯示，原圖組與蛋白初始載量組分析數(shù)據(jù)比值的指數(shù)趨勢線高度吻合；1.6°旋轉(zhuǎn)組趨勢線指數(shù)方程常數(shù)與蛋白初始載量組接近；但3.6°旋轉(zhuǎn)組曲線則有明顯偏離。
      實測提示，條帶旋轉(zhuǎn)使目標(biāo)條帶ROI統(tǒng)計像素群的強(qiáng)度類型，像素數(shù)量都可能發(fā)生改變，結(jié)果導(dǎo)致選區(qū)IntDen值產(chǎn)生誤差。雖然Western Blot條帶圖像旋轉(zhuǎn)角度大小與選區(qū)分析值誤差程度的關(guān)聯(lián)還有待進(jìn)一步觀察。但圖像小角度旋轉(zhuǎn)對Western Blot條帶選區(qū)定量分析產(chǎn)生影響是可以肯定的。因此，在Western Blot實驗需要準(zhǔn)確評估組間量效關(guān)系時，對原始圖像旋轉(zhuǎn)后再分析的做法應(yīng)盡量避免。
      實驗中應(yīng)力爭使條帶的圖像規(guī)整，無疑有利于提高分析的精準(zhǔn)度。

三、在Western Blot實驗中如何解決條帶圖像傾斜對分析結(jié)果的干擾
      Western Blot實驗由于電泳、電轉(zhuǎn)實驗環(huán)境條件、實驗規(guī)程和實驗者操作經(jīng)驗技術(shù)等軟硬件差別，電轉(zhuǎn)獲取的圖像中的條帶排列的不規(guī)整現(xiàn)象極為常見。
      追根溯源，在WB實驗流程中，實驗室創(chuàng)造必要硬件環(huán)境，無疑是確保轉(zhuǎn)印膜上條帶圖像水平規(guī)整行之有效的手段。
      就目前資源而言，有兩種硬件保障措施是可以考慮的。

2.1 用Gel Alignment Template幫助凝膠和轉(zhuǎn)印膜擺放位置規(guī)整
      Gel Alignment Templates，凝膠樣品成像定位板或稱為樣品中心對準(zhǔn)模板，用來快速、精確地定位ChemiDoc MP和ChemiDoc Imaging Systems成像系統(tǒng)的樣品托盤上的凝膠和轉(zhuǎn)印膜樣品。
      外形如同相框，框的外側(cè)與樣品臺成像區(qū)大小匹配，而框內(nèi)尺寸與實驗室常用的凝膠尺寸一致。模板安裝到樣品臺后，只需把待成像樣品擺放到框內(nèi)，框-樣品四周實現(xiàn)嚴(yán)絲合縫，避免出現(xiàn)傾斜現(xiàn)象，從而確保樣品擺放方方正正，所有條帶的圖像保持同一水平位置。
      模板分為mini和midi兩種規(guī)格，凝膠或轉(zhuǎn)印膜通用，與Bio-Rad開發(fā)的樣品托盤完美匹配。

2.2 配置帶樣品自動調(diào)節(jié)功能的Western成像系統(tǒng)
      賽默飛英捷品牌的蛋白免疫印跡成像系統(tǒng)樣品臺沒有伯樂成像系統(tǒng)那樣的樣品定位板，但卻配置可自動調(diào)節(jié)的旋轉(zhuǎn)樣品臺。
      Invitrogen iBright CL750、iBright CL15 Western Blot凝膠成像系統(tǒng)及iBright FL1500 Western Blot凝膠多功能成像系統(tǒng)標(biāo)配的自動機(jī)械式旋旋轉(zhuǎn)載物臺，能自動識別樣品擺放位置，并能自動將樣本順時針或逆時針方向旋轉(zhuǎn)10°，提前修正樣本位置。
      這個功能同樣可使圖像中條帶的位置保持水平一致。這樣有效避免在成像采集完成后軟件實施數(shù)字旋轉(zhuǎn)操作，從而最大程度保持圖像數(shù)據(jù)的原貌完整性。

參考文獻(xiàn)
    ［1］在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應(yīng)用實測-上
    ［2］ImageJ創(chuàng)建Western Blot條帶分析選區(qū)的基本規(guī)則
    ［3］如何用ImageJ為Western Blot條帶定量建立分析選區(qū)