讓ImageJ在Western Blot圖像分析中綻放-6

      《Western Blot條帶定量如何確定ImageJ滾球半徑？》提出，在WB圖像條帶定量分析中，扣除背景滾球半徑值由條帶短軸方向圖像有效強(qiáng)度信號的分布范圍大小決定。
       根據(jù)《如何用ImageJ為Western Blot條帶定量建立分析選區(qū)》提出的條帶分析選區(qū)創(chuàng)建規(guī)則，ROI正是基于條帶短軸方向圖像信號分布范圍來確定邊界的，即ROI的寬度值等于條帶短軸方向圖像強(qiáng)度信號分布的范圍。
       現(xiàn)在的問題：滾球半徑是否就等于條帶選區(qū)寬度值？
       要回答這個問題，還得從Rolling Ball算法原理和Rolling Ball Radius涵義說起。

一、準(zhǔn)確理解Rolling Ball算法和滾球半徑涵義

      《為Western Blot條帶分析背景扣除牛轉(zhuǎn)乾坤的Rolling ball》文中指出，在Western Blot實(shí)驗(yàn)圖像分析中，扣除背景的滾球半徑小，圖像信號強(qiáng)度被當(dāng)作背景成份扣除的多。當(dāng)半徑縮小至不合理水平后，條帶因大量有效信號強(qiáng)度被去除失，會大幅降低ROI統(tǒng)計(jì)值。而滾球半徑增大，滾球與信號強(qiáng)度峰相切切除減少，峰中被保留的信號強(qiáng)度多，條帶ROI統(tǒng)計(jì)值增加。但滾球半徑進(jìn)一步放大后，各條帶檢測值中背景“水份”劇增，滾球扣除背景效果弱化甚至失去作用。

       既然rolling ball理論提出源于自然現(xiàn)象，滾球半徑設(shè)計(jì)也應(yīng)符合基本自然規(guī)律，確保其合理。

       先看一幅采用多個WB條帶Plot profile分析曲線圖經(jīng)裁剪、拼接、倒轉(zhuǎn)后合成演示圖（Fig. 2）。

       圖中3個信號峰，形態(tài)（峰度和偏度）各異，峰口邊緣“地形地勢”有別，各峰口跨度不一。三個滾球Rolling Ball -1，Rolling Ball-2和Rolling Ball-3，分別與Plot-1、Plot-2和Plot-3對應(yīng)。
       各滾球與峰口相應(yīng)的支撐點(diǎn)相切。按照滾球算法原理，A、B之間的范圍屬于有效信號范圍。從A、B切點(diǎn)各自向外側(cè)的信號曲線，皆視為圖像背景,不應(yīng)納入選區(qū)分析范圍。
       從圖上看，Plot 2有Rolling Ball-2a和Rolling Ball-2b兩個滾球。滾球2b半徑過小，球體深陷峰內(nèi)，且球體與峰口邊緣地形走勢并不匹配。反觀滾球2a，與峰接觸的圓弧與峰口外曲線的走勢較匹配。因此，從簡單的自然規(guī)律角度，即可認(rèn)定滾球2a球體半徑尺寸較為合理。
       此時(shí)，弱采用比2a球體直徑更大的滾球經(jīng)過，則球-峰相切點(diǎn)位置會外移。此時(shí)，從2a滾球的角度看，更大球體的切點(diǎn)外移后，使原A、B外側(cè)的圖像背景被收羅進(jìn)入新選區(qū)。按ImageJ指南中滾球半徑是不包含圖像背景前提下的有效信號分布最大范圍尺度的規(guī)則，這明顯與“背景勿入”相悖。
       圖中的球-峰切點(diǎn)A、B之間連線，代表峰口直徑。不同峰口由于周圍“地形”條件不同，對與之匹配滾球的半徑尺寸要求理應(yīng)不同。峰口直徑越大，滾球半徑相應(yīng)也增大。

       在《Western Blot條帶分析中如何確定ImageJ滾球半徑？》已用實(shí)際案例證明，在實(shí)際工作中，脫離峰型實(shí)情，盲目套用50像素“神半徑”進(jìn)行背景扣除分析的做法，是不合理的。

       那么，在Western Blot條帶定量分析中，滾球半徑與選區(qū)寬度、峰口直徑三者之間有何關(guān)聯(lián)？

二、Rolling Ball、ROI寬度和峰口直徑三者間幾何學(xué)邏輯關(guān)系

      將實(shí)測采用實(shí)際WB條帶ROI的Plot Profile圖垂直翻轉(zhuǎn)后合成圖4，有助于直觀了解滾球半徑與選區(qū)寬度、峰口直徑三者之間的內(nèi)在聯(lián)系。
      A、B兩點(diǎn)為峰-滾球的兩個切點(diǎn)。分別經(jīng)過A、B引出圖像橫坐標(biāo)軸和縱坐標(biāo)軸的垂線后，兩條垂直線相較于C點(diǎn)，則A、C、B三點(diǎn)夠成一個直角三角形。三角形斜邊AB長度代表峰口直徑。CB對應(yīng)信號峰的水平分布范圍，即ROI寬度。
      過AB中點(diǎn)M做AB垂直平分線，并任取O代表滾球圓心。則OA即該滾球的半徑R,MO與OA夾角為θ。 

      滾球半徑R與峰口直徑AB的計(jì)算公式為：

       圖4和計(jì)算公式表明，AB長度確定的情況下，O下移至M點(diǎn)，此時(shí)θ為90°，滾球直徑剛好等于AB時(shí)，滾球作用毫無意義；
       圓心O外移，滾球半徑增大，球體于峰內(nèi)的弧線趨于平直，峰-球交集減少，峰內(nèi)保留的有效信號強(qiáng)度增多。當(dāng)滾球半徑增長超出極限，圓弧線與接近AB線段無限接近，背景扣除部分劇減，去背景效應(yīng)幾近于詢價(jià)，同樣毫無意義。
      因此，R取值范圍并非存粹的數(shù)學(xué)計(jì)算問題，它是有“存在合理性”限制范圍的。超出此范圍后，滾球會失去應(yīng)用價(jià)值和存在的必要。
      按ImageJ指南描述內(nèi)容，滾球半徑R取值（“經(jīng)驗(yàn)值”）范圍是R≥AB。
      而基于直角三角形邊長計(jì)算公式，滾球半徑R≥CB。
      這就從原理上回答了本文開頭部分提出的問題，即：滾球半徑不應(yīng)低于ROI寬度；它可以等于峰口直徑。
      此外，從圖上看，幾何知識還給了我們?nèi)缦掠袃r(jià)值的啟示：
      1）峰口直徑長度（AB）不僅與選區(qū)寬度（CB）有關(guān)，還與AB兩點(diǎn)高程落差（AC）有關(guān)。
      2）AB的高程差，在Western Blot條帶圖像中，代表的涵義是條帶短軸方向上圖像背景信號強(qiáng)度差異。
      相同寬度的條帶，如選區(qū)ROI兩側(cè)背景強(qiáng)度落差不同，導(dǎo)致AB長度有區(qū)別，進(jìn)而使?jié)L球半徑也發(fā)生改變（Fig. 2-1）。

      此外，當(dāng)ROI兩側(cè)圖像背景強(qiáng)度落差小時(shí)或落差極小，意味著條帶背景分布極其均勻，此時(shí)AB將無限接近CB，使得滾球半徑實(shí)際上接近于ROI寬度。根據(jù)公式計(jì)算的AB值等于CB值的現(xiàn)象，在WB條帶實(shí)測中確實(shí)屢見不鮮。

      AB高程差與AB長度之間的有趣現(xiàn)象，再次驗(yàn)證了《為Western Blot條帶分析背景扣除牛轉(zhuǎn)乾坤的Rolling ball》和《在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應(yīng)用實(shí)測》文中的觀點(diǎn)，即：滾球半徑不僅由帶條本身信號分布范圍尺度決定，同時(shí)還受到條帶選區(qū)所處圖像背景分布條件限制。
      因此，在WB條帶蛋白定量分析過程中，不同條帶應(yīng)采用“一帶一景”分析法則。而所謂網(wǎng)紅半徑，是不切實(shí)際的想法。

三、Western Blot條帶定量分析中滾球半徑測算方法

       實(shí)測中，我們采用直線工具法測算Rolling Ball半徑值。即借助于ImageJ軟件的直線工具length，直接測量AB長度值。
       在Plot profile結(jié)果顯示窗口中，選擇工具欄的直線選區(qū)工具，以A為起點(diǎn)像B引出直線，工具欄下部會適時(shí)顯示鼠標(biāo)所在位置對應(yīng)線段的長度值。
       當(dāng)鼠標(biāo)移到B點(diǎn)時(shí)，請注意用鍵盤截屏功能，截屏保存軟件測得的AB長度值。 

       如圖Fig.5a所示，測得AB長度為9.50像素。

       該方法操作直觀簡便，測量精度控制要點(diǎn)在于確保直線工具的起止點(diǎn)與曲線首位兩端的高度重合。為此，可以將Plot profile顯示窗口拉大，這樣便于識別鼠標(biāo)中心與曲線末端的對準(zhǔn)程度。

       但該方法缺陷是測算結(jié)果人為誤差較大。引出的AB線段操作中，受電腦屏幕分辨率和屏幕大小、手工操作定位精準(zhǔn)度影響，操作過程測量精度的控制有一定難度。因而不同場次操作中，ROI的統(tǒng)計(jì)數(shù)值往往存在小幅波動。

四、結(jié)語

      因條件所限，目前還無法對《Biomedical image processing》的rolling ball algorithm理論方法作詳盡研究，加之ImageJ圖像分析軟件應(yīng)用于Western Blot條帶定量分析的經(jīng)驗(yàn)尚缺，目前提出的Rolling ball半徑計(jì)算方法有效性還有待進(jìn)一步檢驗(yàn)。

      滾球半徑尺寸要基于具體的ROI計(jì)算。每個條帶短軸方向的形態(tài)、背景分布存在區(qū)別，滾球半徑計(jì)算值必然存在差異。這正是《為Western Blot條帶分析背景扣除牛轉(zhuǎn)乾坤的Rolling ball》所提的一“徑”難求的道理。

       “一帶一景”分析策略，更適合應(yīng)用于精確定量型Western Blot圖像分析。因此，滾球半徑不是經(jīng)驗(yàn)值，是具體條帶具體計(jì)算的親測值。采用不切實(shí)際的統(tǒng)一滾球半徑用于分析，無異于緣木求魚，不僅有悖于ImageJ指南中提出滾球半徑設(shè)定要求，甚至還將數(shù)據(jù)分析結(jié)果引入歧途。 

       至于本文開頭部分提出的問題，總結(jié)的話就是：滾球半徑值多數(shù)情況下等于信號峰的峰口直徑二大于選區(qū)寬度值；只有當(dāng)條帶短軸方向的前、后緣圖像背景均勻一致且強(qiáng)度落差很小時(shí)，峰口直徑或滾球半徑測算只等于條帶寬度。

     《ImageJ創(chuàng)建Western Blot條帶分析選區(qū)的基本規(guī)則》提出ROI科學(xué)合理創(chuàng)建是分析工作成功的基礎(chǔ)。原因就在于ROI創(chuàng)建后，條帶分布范圍、峰口形狀都已界定，滾球半徑值是木已成舟，呼之欲出。依托ROI計(jì)算Rolling ball半徑，可以有效降低主觀隨意性和誤差。

      需指出，僅掌握滾球半徑算法，對于Western Blot圖像條帶定量分析還不夠。細(xì)心的讀者或許已經(jīng)注意到，在《圖像灰度值在Western Blot條帶定量分析中應(yīng)用的實(shí)測-上》一文中，實(shí)施“一帶一景”時(shí)，不同WB條帶的分析選區(qū)除采用差異化的滾球半徑值，還存在sliding paraboloid和Disable Smooth兩個選項(xiàng)引入與否的問題。

      如何為Subtract Background有效設(shè)置sliding paraboloid和Disable Smooth選項(xiàng)問題，留待《ImageJ軟件中Sliding Paraboloid的涵義及在WB條帶分析中的應(yīng)用初探》和《ImageJ軟件Smoothing算法的涵義及在Western Blot條帶定量中運(yùn)用初探》來討論。

參考文獻(xiàn)

［1］ImageJ User Guide (IJ 1.46r)