微需氧菌（microaerophilic bacterium）是指能在3% - 15% (v/v) 氧氣含量環(huán)境下生長、在20-21%氧含量大氣及無氧環(huán)境中生長受抑制細(xì)菌的統(tǒng)稱。除了空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni ）、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,HP）等報(bào)道較多的人體致病菌外，還包括腸道中微需氧型雙歧桿菌，淡水、海洋硫化物等沉積物及廢水生物膜中硫酸鹽還原細(xì)菌（Sulfate-Reducing Bacterial, SRB），Zetaproteobacteria代表的近岸海洋沉積物、海底熱液環(huán)境中的嗜中性微需氧鐵氧化菌（FeOB）及從溫泉中分離的微需氧菌等多種寄生菌。

       微需氧菌常在含5%-O₂,10%-CO₂和85%-N₂的氣體環(huán)境、28- 42℃溫度下培養(yǎng)。培養(yǎng)方法有玻璃缸蠟燭培養(yǎng)法、氣囊培養(yǎng)法、厭氧罐培養(yǎng)法（Anaerobic Jar）、三氣培養(yǎng)箱法（multigas incubator）和微需氧工作站（Microaerobic Workstations）培養(yǎng)法等。

燭缸培養(yǎng)法和氣囊培養(yǎng)法難以穩(wěn)定維持的氣體含量。

       厭氧罐培養(yǎng)系統(tǒng)由氣瓶、氣體控制單元和培養(yǎng)罐組成，具有充排氣的氣體置換、氧氣（1%-15%)和CO₂（5%-15%）濃度的自動(dòng)控制功能，可提供穩(wěn)定低氧培養(yǎng)環(huán)境。系統(tǒng)無法調(diào)控培養(yǎng)罐工作溫度，故須將培養(yǎng)罐置于恒溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱或霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

       三氣培養(yǎng)箱(multigas incubator)具備常規(guī)微需氧菌培養(yǎng)所需的O₂（1% - 18%）、CO₂（0% - 20%）、溫度（RT+5℃ - +50℃）及濕度控制條件，但缺少樣品準(zhǔn)備環(huán)節(jié)低氧操作環(huán)境。

       微需氧工作站集O₂、CO₂及溫濕度自動(dòng)控制功能于一體，既是天然的低氧培養(yǎng)箱，又兼樣品制備的低氧環(huán)境操作臺(tái)，為微需氧菌實(shí)驗(yàn)樣品制備、接種培養(yǎng)和檢測(cè)分析全流程的解決方案。既可置于普通實(shí)驗(yàn)桌面工作，也可訂制專用工作臺(tái)架連同氣瓶、真空泵等輔助裝置安裝于實(shí)驗(yàn)室一角運(yùn)行使用。

       厭氧工作站和微需氧工作站兩者的整體結(jié)構(gòu)基本一致，故有廠商將二者合稱厭氧/低氧工作站，寓意可一機(jī)兩用。事實(shí)上，二者的治氧目標(biāo)、技術(shù)途徑、硬件配置及支持氣體均存在明顯區(qū)別。本文基于工作站的氣體環(huán)境調(diào)控機(jī)制來探討微需氧工作站軟硬件、配套氣體需求的特殊性，以便讀者在工作站的使用與選擇上胸有成竹。

一、微需氧工作站的艙內(nèi)環(huán)境調(diào)控機(jī)制

       微需氧工作站的一個(gè)核心功能是將工作艙內(nèi)空氣中氧分壓從20.9%降至5-6%的水平并長期維持穩(wěn)定。在運(yùn)行前，工作艙內(nèi)充填的是空氣。

       若將空氣理想化為由O₂-21%、N₂-78.1%及1%其它氣體組成，無NO₂、H₂S、甲醛等有毒成份及塵埃污染的標(biāo)準(zhǔn)混合氣體。則無需將艙內(nèi)氣體抽出一半后，僅輸入CO₂、N₂，即可使艙內(nèi)氣體環(huán)境達(dá)到設(shè)定目標(biāo)。

       但因地域、環(huán)境、氣候及天氣等條件影響，加之空氣中的塵埃及硫化氫、揮發(fā)性有機(jī)物（VOC）、NO₂等有毒氣體污染的存在，為確保最終氣體環(huán)境一致性，標(biāo)準(zhǔn)流程應(yīng)是先真空排出工作艙內(nèi)空氣，再按氣體組成比例（如85%-N2：10%-CO₂：5%-O₂）輸入高純度工作氣體來完成氣體置換。

       在有氧呼吸鏈傳遞系統(tǒng)中，質(zhì)子和電子的最終受體是O₂。菌體從環(huán)境中攝取1mol O₂可產(chǎn)生2mol水蒸氣。微需氧菌一方面攝入CO₂，另一方面在有氧呼吸過程中消耗O₂并排放代謝產(chǎn)物CO₂和水蒸氣。微需氧菌攝取CO₂的動(dòng)機(jī)仍不十分清楚，但作為非固碳菌，理論上，培養(yǎng)過程中的排碳應(yīng)高于固碳。最終結(jié)果是：工作艙內(nèi)O₂消耗低于CO₂和水蒸氣的盡增長，氣體總量上升。

       微需氧菌通常需在含高濃度（5%-10%）CO₂的氣體環(huán)境下培養(yǎng)。而系統(tǒng)根據(jù)O₂、CO₂傳感器檢測(cè)結(jié)果和控制算法，自動(dòng)輸入相應(yīng)流量的O₂、N₂，將O₂、CO₂的氣體分壓恢復(fù)至設(shè)定水平。通過自動(dòng)泄壓裝置釋放部分氣體，可保持艙內(nèi)氣壓的正常。無論是工作氣流輸入、艙內(nèi)氣壓維持，全部由系統(tǒng)自動(dòng)控制，無需人工干預(yù)。

       高純度的輸入氣體易造成培養(yǎng)基風(fēng)干脫水。數(shù)字化濕度控制單元可控制直熱式水汽蒸汽發(fā)生器或艙外水汽霧化裝置，將艙內(nèi)環(huán)境濕度維持在70% R.H.的默認(rèn)值或更高（85-95% R.H.）設(shè)定水平。當(dāng)艙內(nèi)濕度超過設(shè)定值，系統(tǒng)則啟動(dòng)除濕機(jī)制，風(fēng)扇驅(qū)動(dòng)艙內(nèi)氣體循環(huán)，在流經(jīng)半導(dǎo)體制冷控制冷凝器時(shí)，將水汽快速冷凝幫你改收集到艙外集水瓶中，從而降低艙內(nèi)濕度。

       微需氧菌培養(yǎng)環(huán)境溫度通常高于20℃-26℃的室溫。系統(tǒng)通過升溫加熱和柜體自動(dòng)對(duì)外輻射散熱的控溫機(jī)制，將艙內(nèi)溫度（RT+5℃-+65℃）維持穩(wěn)定。

       可見，在氣壓與溫濕度這幾個(gè)工作環(huán)境參數(shù)調(diào)控、真空泵運(yùn)用方面，微需氧工作站與厭氧工作站基本一致。二工作艙內(nèi)氣體環(huán)境調(diào)控的具體對(duì)象和調(diào)控機(jī)制，則存在根本區(qū)別。這就給微需氧工作站在配套體、硬件配置和系統(tǒng)控制層面都提出了不同要求。

二、微需氧工作站運(yùn)行配套氣體需求

       微需氧工作站艙要精確控制工作艙段O₂、CO₂兩種氣體的組成比例并保持穩(wěn)定，必然要從外部引入O₂和N₂氣體。在已知CO₂和水蒸氣分子總量盡增長背景下，為維持5%-O₂、10%-CO₂和85%-N₂這一比例，O₂輸入量必高于實(shí)際消耗量，同時(shí)補(bǔ)充N₂。

       假設(shè)某個(gè)培養(yǎng)階段，工作艙內(nèi)消耗了2體積的O₂、新增1體積的CO₂排放。則系統(tǒng)需輸入輸入2.69體積O₂外加10.1體積N₂，或直接補(bǔ)充12.81體積的壓縮空氣中（O₂組成比例約21%），將艙內(nèi)O₂、CO₂比例恢復(fù)。可見，用單一壓縮空氣替代相對(duì)昂貴的N₂、O₂兩種純凈氣體用作艙內(nèi)兩種氣體的補(bǔ)充來源方案，是經(jīng)濟(jì)而可行的。

       工作站的操作過程保留了N₂吹掃環(huán)節(jié)，以防外部空氣經(jīng)樣品轉(zhuǎn)移艙、袖套窗口與艙內(nèi)氣體對(duì)流而破壞艙內(nèi)O₂穩(wěn)態(tài)。因此，標(biāo)準(zhǔn)微需氧工作模式下，工作站運(yùn)行所需配套氣體為三種，即N₂（轉(zhuǎn)移艙及操作袖套的N2吹掃）、CO₂（在初始階段提供10%濃度的CO₂）和壓縮空氣（正常工作狀態(tài)下艙內(nèi)O₂含量的維持）。這與厭氧工作站的N₂+AMG、三氣培養(yǎng)箱的N2、CO₂雙氣源供氣模式都不同。

       包括幽門螺桿菌和空腸梭菌在內(nèi)，超過200種病原菌攜帶有氫化酶基因。氫化酶（hydrogenases）的作用在物種、不同菌株間存在差異。氫化酶不僅在微生物呼吸鏈中攝入的H₂裂解成電子和質(zhì)子，質(zhì)子氧化產(chǎn)能產(chǎn)生PMF。一些腸道菌群還借助于氫化酶發(fā)酵產(chǎn)升H₂，并在腸道組織中擴(kuò)散和飽和。幽門螺桿菌呼吸鏈中PMF產(chǎn)生具有結(jié)腸微生物群產(chǎn)H₂依賴性。鼠傷寒沙門氏菌、空腸彎曲桿菌、簡易彎曲桿菌和幽門螺桿菌（包括致癌菌株）等幾種病原體，利用宿主結(jié)腸組織中分子氫為呼吸基質(zhì)（respiratory substrate），對(duì)其生長和毒力表現(xiàn)至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在培養(yǎng)氣體中添加H₂，幽門螺桿菌菌體數(shù)量在16小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)40% - 60%的增長，且10小時(shí)內(nèi)從[¹⁴C]碳酸氫鹽積累的碳增加了3倍。H₂使得幽門螺桿菌在胃腸道定植（colonization）中保持關(guān)鍵的競(jìng)爭優(yōu)勢(shì)。

       微需氧菌培養(yǎng)中是否需引入H2問題，目前學(xué)界并無一致意見。但空腸彎曲桿菌、幽門螺桿菌的培養(yǎng)氣體中添加H2的應(yīng)用（(5%-O₂, 2%-H₂, 88%-N₂, 5%-CO₂）早有報(bào)道。從目前公開報(bào)道看，多數(shù)微需氧菌實(shí)驗(yàn)用的是三氣培養(yǎng)模式。

       加H2的辦法是在微需氧培養(yǎng)三組氣體基礎(chǔ)上增加一路H_2-N₂混合氣源。這樣，H2、N₂、CO₂和空氣構(gòu)成了微需氧工作站的四氣工作模式。

三、微需氧工作站的硬件配套要求

       厭氧工作站無論配置厭氧指示劑定性或氧氣傳感器定量監(jiān)測(cè)，均可滿足O₂含量控制在安全界限以下的調(diào)控要求。

       微需氧工作站在三氣模式下，要實(shí)時(shí)定量檢測(cè)O₂、CO₂兩種氣體含量，并根據(jù)傳感器讀數(shù)，自動(dòng)調(diào)整壓縮空氣的輸入量，確保O₂含量維持在設(shè)定值。而四氣工作模式下，則須在三氣應(yīng)用配置基礎(chǔ)上增加H₂傳感器及配套氣路控制單元。

       如采用肉眼觀察氧氣指示劑或氧氣傳感器讀數(shù)，人工計(jì)算、手工控制各種氣體的輸入量，容易出現(xiàn)操作失誤，以致艙內(nèi)氧氣含量偏離設(shè)定范圍，危及樣品安全。多個(gè)參數(shù)手工控制方式，極大增加操作負(fù)擔(dān)，對(duì)操作者個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)和操作熟練程度要求極高，不適用于大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)者。因此，微需氧工作站一般采用觸摸屏操作設(shè)置工作，系統(tǒng)通過PLC核心控制器，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置集中對(duì)多環(huán)節(jié)、多參數(shù)自動(dòng)化調(diào)控管理。市面上，DWS H35、江雪AG300 plus、Mini Station Plus、E500、E500G、QD500、E600，龍躍LAI-3T-N20、LAI-3DT等數(shù)字化自動(dòng)控制的機(jī)型，是可以用作微需氧培養(yǎng)基礎(chǔ)架構(gòu)的。

       微需氧氣體環(huán)境穩(wěn)定須依托對(duì)多種工作氣體流量的精確控制。采用三氣運(yùn)行模式的DWS H35、H25低氧工作站，設(shè)有N₂、CO₂和壓縮空氣三個(gè)獨(dú)立氣路接口，每個(gè)氣路的流量、啟閉都由系統(tǒng)獨(dú)立控制。而DWS M35微需氧工作站是標(biāo)準(zhǔn)四氣工作模式，內(nèi)部氣路結(jié)構(gòu)與控制模塊更為復(fù)雜。

       國產(chǎn)微需氧（低氧）工作站，一般基于標(biāo)準(zhǔn)厭氧工作站雙氣工作氣路結(jié)構(gòu)（一個(gè)N₂、一個(gè)AMG氣體）設(shè)計(jì)，標(biāo)準(zhǔn)配置下無法直接管控3-4種工作配套氣體。構(gòu)建微需氧環(huán)境，須引入獨(dú)立外置氣體混合器模塊。氣路具體接入方法是：N₂瓶與機(jī)身N₂專用輸入接口直接連接；CO₂、空氣及H₂需與氣體混合器上相應(yīng)氣體輸入接口連接，通過混合器輸出端口，與工作站的AMG輸入口對(duì)接。氣體混合器根據(jù)設(shè)置參數(shù)，可在多種氣體間切換和根據(jù)指令選擇性開放、關(guān)閉所需的氣體控制閥。

       當(dāng)然，系統(tǒng)軟件首先得有CO₂、空氣、H₂參數(shù)控制界面入口。DWS H35低氧工作站操作界面無H₂設(shè)置功能，可用于三氣模式下的微需氧環(huán)境控制，但不適用于四氣工作模式。

四、小結(jié)

       微需氧工作站集實(shí)驗(yàn)樣品準(zhǔn)備操作和培養(yǎng)于一體，有效彌補(bǔ)常規(guī)缸蠟燭培養(yǎng)、氣囊培養(yǎng)、厭氧罐培養(yǎng)及三氣培養(yǎng)箱的缺少樣品操作空間上的不足。工作艙內(nèi)O₂、CO₂、H₂、溫度、濕度等工作參數(shù)全自動(dòng)、實(shí)時(shí)精確控制，是實(shí)現(xiàn)微需氧菌、微需氧寄生蟲（如藍(lán)賈第鞭毛蟲、陰道毛滴蟲等）、哺乳動(dòng)物細(xì)胞低氧培養(yǎng)應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)工具。

       由于工作艙內(nèi)氣體調(diào)控對(duì)象、目標(biāo)方法的差異，微需氧工作站從系統(tǒng)控制軟件、艙內(nèi)氣體傳感器配置種類、工作氣體的輸入與控制單元，與厭氧工作站的應(yīng)用配置均顯著不同。一般說來，通過簡單的氣瓶更換，微需氧工作站可以秒變?yōu)閰捬豕ぷ髡?；但厭氧工作站要?shí)現(xiàn)到微需氧工作站的絢麗轉(zhuǎn)身，單靠靠邁出切換氣瓶這一步還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

參考文獻(xiàn)

[1] Diksha Pokhrel, Hudson T. Thames, Li Zhang, et al. Roles of Aerotolerance, Biofilm Formation, and Viable but Non-Culturable State in the Survival of Campylobacter jejuni in Poultry Processing Environments. Microorganisms. 2022 Nov; 10(11): 2165.

[2] Tsukasa Ito, Satoshi Okabe, Hisashi Satoh, et al. Successional Development of Sulfate-Reducing Bacterial Populations and Their Activities in a Wastewater Biofilm Growing under Microaerophilic Conditions. Appl Environ Microbiol. 2002 Mar; 68(3): 1392–1402.  doi: 10.1128/AEM.68.3.1392-1402.2002

[3] Tsukasa Ito, Satoshi Okabe, Hisashi Satoh, et al. Successional Development of Sulfate-Reducing Bacterial Populations and Their Activities in a Wastewater Biofilm Growing under Microaerophilic Conditions. Appl Environ Microbiol. 2002 Mar; 68(3): 1392–1402.

[4] 孫明雪, 宿蕾, 李江濤. 海底熱液環(huán)境中嗜中性微需氧鐵氧化菌的多樣性、生物礦化作用及其代謝特征. 微生物學(xué)報(bào), 2022, 62(6): 2119-2135

[5] Kian Mau Goh, Kok Jun Liew, Saleha Shahar, et al. Draft Genome Sequence of Microaerobacter geothermalis Nad S1T, a Microaerophilic Bacterium Isolated from Tenusia Hot Spring. Microbiol Resour Announc. 2022 May; 11(5): e00088-22.

[6] Khan I.U.H., Hill S., Nowak E., Edge T.A. Effect of Incubation Temperature on the Detection of Thermophilic Campylobacter Species from Freshwater Beaches, Nearby Wastewater Effluents, and Bird Fecal Droppings. Appl Environ Microbiol. 2013;79:7639–7645.

[7] Lu Liang, Nicholas B. Carrigy, Samuel Kariuki, et al. Development of a Lyophilization Process for Campylobacter Bacteriophage Storage and Transport. Microorganisms. 2020 Feb; 8(2): 282.

[8] Stéphane L. Benoit, Robert J. Maier, R. Gary Sawers, et al. Molecular Hydrogen Metabolism: a Widespread Trait of Pathogenic Bacteria and Protists. Microbiol Mol Biol Rev. 2020 Mar; 84(1): e00092-19.

[9] Kuhns LG, Benoit SL, Bayyareddy K, et al. Carbon fixation driven by molecular hydrogen results in chemolithoautotrophically enhanced growth of Helicobacter pylori. J Bacteriol. 2016; 198:1423–1428.
[10] David Leitsch. Drug Resistance in the Microaerophilic Parasite Giardia lamblia. Curr Trop Med Rep. 2015; 2(3): 128–135.
[11] Installation Requirements for a Whitley H35 Hypoxystation.
[12] Installation Requirements for a Whitley M35 Microaerobic Workstation.