厭氧工作站（Anaerobic Workstations），也稱作無氧實(shí)驗(yàn)艙、厭氧培養(yǎng)箱（Anaerobic Chambers），是具有封閉艙體、可調(diào)控艙內(nèi)氣體組成與含量、溫濕度條件的多功能實(shí)驗(yàn)箱。其核心功能是將艙內(nèi)氧氣含量控制在5 ppm（氧體積百分比0.0005%）以下，為厭氧微生物的樣品制備分離、培養(yǎng)和鑒定提供了持續(xù)、穩(wěn)定的無氧環(huán)境。工作艙既是優(yōu)良的樣品準(zhǔn)備場(chǎng)所，又是標(biāo)準(zhǔn)的恒溫恒濕厭氧培養(yǎng)箱。因此，作為基礎(chǔ)條件裝備，厭氧工作站已廣泛而深入地應(yīng)用在臨床醫(yī)學(xué)與動(dòng)物疾病預(yù)防、致病菌藥敏鑒定、食品工業(yè)發(fā)酵、極端微生物研究、微生物組研究（Microbiome Studies）、環(huán)境微生物學(xué)及生物能源研究等多學(xué)科領(lǐng)域。

       與生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床等其它微生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備相比，厭氧工作站的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、參數(shù)控制、操作流程和運(yùn)行條件要復(fù)雜。為便于讀者自覺、安全地使用與維護(hù)好厭氧工作站，本文從厭氧工作機(jī)制出發(fā)，來討論工作站運(yùn)行的氣體管理問題。

一、厭氧工作站的除氧機(jī)制

       厭氧工作站通常采用物理手段（抽真空排氣、氮?dú)馓畛湎♂專┡c化學(xué)手段（鈀催化劑除氧）相結(jié)合的方法來簡(jiǎn)便高效地除去工作艙內(nèi)氧氣。

       先啟動(dòng)真空泵，快速地將工作艙內(nèi)大部分空氣排出，但仍有少量空氣的稀薄分布。

       隨后向艙內(nèi)緩慢填充99.99%食品級(jí)高純氮?dú)猓∟₂），目的是將殘留空氣大幅稀釋。充氣完成后立即啟動(dòng)真空排氣，完成一次氮?dú)庵脫Q操作。氮?dú)庵脫Q操作重復(fù)1-2次后，艙內(nèi)O₂殘量可低至0.1%上下。因真空泵工作性能及箱體結(jié)構(gòu)強(qiáng)度限制，再繼續(xù)增加氮?dú)庵脫Q操作循環(huán)次數(shù)，對(duì)進(jìn)一步降低艙內(nèi)O₂含量不僅收效甚微，而且耗時(shí)、費(fèi)氣。此時(shí)，需要執(zhí)行混合氣置換與鈀催化劑化學(xué)除氧流程。

       鈀催化除氧的基本過程是：在2輪氮?dú)庵脫Q操作完成后，向工作艙內(nèi)輸入含5%或10%比例H₂的厭氧混合氣體（anaerobic mixed gas, AMG），即混合氣置換操作。借助于金屬鈀對(duì)H2的強(qiáng)大吸附作用，用風(fēng)扇使艙內(nèi)氣體循環(huán)流經(jīng)鈀催化劑層可將O₂捕獲，并迅速催化O₂與H₂反應(yīng)生成H₂O，氣流將水蒸氣帶走。當(dāng)艙內(nèi)相對(duì)濕度過大時(shí)，工作站配備的濕度自動(dòng)控制單元將其冷凝后收集并導(dǎo)出艙外。

       DWS公司的A20/A25/A35，Shellab公司的Bactron 300-2，龍躍LAI-3T-N20等新型厭氧工作站，采用了自動(dòng)厭氧氣體置換循環(huán)控制功能（automatic commissioning cycle）。按下此功能鍵后，無需人工干預(yù)，系統(tǒng)自動(dòng)啟動(dòng)2輪氮?dú)?1輪混合氣的標(biāo)準(zhǔn)置換操作流程，直至工作站實(shí)現(xiàn)厭氧狀態(tài)。

       厭氧工作站的化學(xué)除氧環(huán)節(jié)選擇鈀催化劑（palladium catalyst），有2個(gè)重要原因。

       一是鈀金屬對(duì)H₂、O₂所特有的超高吸附能力。

       氣態(tài)分子和固金屬表面的吸附是異相催化的基礎(chǔ)。鈀（Palladium, Pd）是鉑（platina, Pt）系過渡金屬元素，原子容易失去外層d軌道上的電子。吸附于金屬表面的H2分子獲得電子后，分子內(nèi)部H-H鍵斷裂，解離成H原子而活化，與Pd原子形成Pd—H共價(jià)鍵或Pd—H吸附鍵，這一過程稱作解離吸附（dissociative-adsorption）過程。正是Pd—H化學(xué)鍵的形成，使鈀表面吸附H2效率極高。常溫下，海綿網(wǎng)狀鈀催化劑表面可吸附相當(dāng)于自身體積850倍的H₂。

       大量活性H原子吸附在鈀網(wǎng)表面，并可在鈀表面自由移動(dòng)，如同鈀催化劑布置的巡邏兵。當(dāng)遇到循環(huán)氣流送來并與鈀吸附的O₂時(shí)，憑借數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)的H原子與O原子結(jié)合秒變成水，而水分子則自動(dòng)從催化劑表面脫吸并被艙內(nèi)循環(huán)氣流帶走。

通常，工作艙內(nèi)氣體經(jīng)過數(shù)十分鐘循環(huán)后，O₂含量即可控制在可接受的5ppm以下的安全水平，滿足厭氧實(shí)驗(yàn)樣品工作要求。

       二是鈀催化劑的經(jīng)濟(jì)性。

       鈀制劑的催化活性、穩(wěn)定性和選擇性俱佳，早已在石油、化工、制藥和汽車發(fā)動(dòng)機(jī)尾氣處理等工業(yè)生產(chǎn)中實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；瘧?yīng)用和量產(chǎn)。因此，厭氧工作站采用鈀催化劑除氧的方法，不僅技術(shù)上成熟、可靠和高效，而且鈀制劑易于獲得。

       將厭氧工作艙內(nèi)的空氣置換成厭氧氣體環(huán)境走的是真空-氮?dú)庀♂?鈀催化除氧的基本技術(shù)路線。而將艙內(nèi)氣體長(zhǎng)期維持在安全厭氧水平，也是這一思路。

       正常運(yùn)行狀態(tài)下，工作站厭氧狀態(tài)維持，主要是通過N₂吹掃和厭氧混合氣體補(bǔ)充這2個(gè)措施來保障的。

1、進(jìn)站N₂吹掃（flush lock），阻斷外來氧源

       外來O₂進(jìn)入工作艙主要通過實(shí)驗(yàn)樣品容器轉(zhuǎn)移艙（Flushing interlock or airlock）和手部操作窗（glove ports or sleeved ports）兩個(gè)途徑。

       為便于培養(yǎng)操作器皿、小型儀器和樣品的批量轉(zhuǎn)移。標(biāo)準(zhǔn)尺寸的厭氧工作站通常都設(shè)置專用的樣品轉(zhuǎn)移艙。轉(zhuǎn)移艙有內(nèi)、外兩道密封門。內(nèi)門打開后直通工作艙。外門開啟時(shí)與實(shí)驗(yàn)室環(huán)境連通。內(nèi)外門不可同時(shí)開啟，以防止工作站內(nèi)、外空氣的直接對(duì)流。

       DWS A25、A35厭氧工作站具有轉(zhuǎn)移艙內(nèi)門、外門和氮?dú)獯祾呗?lián)動(dòng)智能管理功能：內(nèi)外門中任一道密封門處于開啟狀態(tài)，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)限制另一扇門的開啟，確保內(nèi)外門不能同時(shí)開啟；此外，轉(zhuǎn)移艙未完成氮?dú)獯祾邥r(shí)，也無法打開內(nèi)門。這樣可有效防止人為操作失誤破壞內(nèi)部厭氧環(huán)境。

       正常情況下，在內(nèi)門關(guān)閉狀態(tài)下，從工作站外將所需容器放入轉(zhuǎn)移艙后并封閉外門后，立即進(jìn)行轉(zhuǎn)移艙N2吹掃操作。N₂吹掃與工作艙物理除氧原理和方法基本一致。

       厭氧工作站正常運(yùn)行時(shí)，艙內(nèi)氣體對(duì)于站外空氣、轉(zhuǎn)移艙始終保持一定正壓水平，萬一工作站發(fā)生漏氣，正壓可阻止艙外空氣進(jìn)入艙內(nèi)。轉(zhuǎn)移艙處于保壓狀態(tài)時(shí)，內(nèi)部氣壓低于工作艙氣壓也是出于同樣考慮。

       轉(zhuǎn)移艙N₂吹掃設(shè)置真空抽排氣，主要是基于兩方面的考慮。

       首先與厭氧工作站氣體工作壓力設(shè)置有關(guān)。英美品牌工作站的工作氣體輸入表壓為0.2-0.6Mpa以上（2-6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓），高于轉(zhuǎn)移艙內(nèi)的氣壓。電磁閥開啟，氣體即可自動(dòng)流入和充填氣壓較低的轉(zhuǎn)移艙。而龍躍LAI-3T-N20等國產(chǎn)工作站所用的吹掃氣瓶輸出氣壓通常為0.05-0.08Mpa（0.5-0.8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓），不僅低于工作艙、轉(zhuǎn)移艙內(nèi)氣壓，也低于站外空氣氣壓。因此，工作站內(nèi)各艙段氣體置換過程的充、排氣都離不開真空泵的運(yùn)行。特別是排氣階段，真空泵可令氣體清除更徹底。

       其次是更有效地消除轉(zhuǎn)移物品攜帶的氧氣。真空排氣過程中，被轉(zhuǎn)移器具內(nèi)部空腔所攜帶常壓空氣、樣品溶液中的溶解氧氣因真空效應(yīng)更易于逸出而被一并抽離，減少隨器皿轉(zhuǎn)移帶入的氧氣。

       轉(zhuǎn)移艙的N₂吹掃通常要進(jìn)行2個(gè)循環(huán)，以盡可能驅(qū)除艙內(nèi)空氣。通常，在2輪N₂吹掃循環(huán)后還可增加一個(gè)混合氣充填步驟，再將物品轉(zhuǎn)入工作艙。轉(zhuǎn)移艙容積不過10-40L，吹掃操作可在15-20分鐘內(nèi)完成。吹掃過程也可由自動(dòng)程序控制來完成。

       袖套式操作窗通常也需執(zhí)行N2吹掃操作。

2、厭氧混合氣補(bǔ)充消除氧氣增量

       N₂吹掃循環(huán)通常難以徹底消除實(shí)驗(yàn)用品具、手部出入工作站時(shí)吸附于皮膚以及手與乳膠手套間隙中攜帶的少量O₂。此外，而艙內(nèi)樣品溶液所攜帶的氧氣也會(huì)陸續(xù)釋出。

       厭氧工作站配置的氧氣指示劑或高精度氧氣傳感器，用于指示艙內(nèi)O₂含量。

       當(dāng)外源性氧氣積聚勢(shì)必造成艙內(nèi)氧含量的上升。當(dāng)升幅足以觸發(fā)氧傳感器讀數(shù)改變或指示劑顏色改變足以為操作者肉眼可分辨的程度時(shí)，在手工操作或系統(tǒng)PLC自動(dòng)控制下，向艙內(nèi)緩慢（通常流速可低至10mL/min）注入相應(yīng)體積的氫氣，將多余的O₂清除，直至艙內(nèi)重新恢復(fù)到安全厭氧狀態(tài)。

二、厭氧工作站運(yùn)行配套氣體需求

       厭氧工作站運(yùn)行的氣體有兩種，高純度N2和混合氣體AMG。N₂的作用是用于工作艙、轉(zhuǎn)移艙和袖套的氣體置換，工作流速可高達(dá)10-25 L/min，消耗量大。AMG主要作用包括氣體置換和運(yùn)行過程化學(xué)除氧兩方面?？梢?，兩種氣體中，AMG是剛需。

       AMG是由N₂、H₂和CO₂三種氣體按一定比混合后制成的。既然N₂、H₂即可滿足運(yùn)行要求，為何要添加CO₂？這是由N₂、H₂和CO₂三種氣體各自的生產(chǎn)、儲(chǔ)運(yùn)條件特殊性決定的。

       N₂的臨界溫度（Curie temperature/Tc，即物質(zhì)氣、液態(tài)共存并達(dá)到平衡時(shí)溫度）-146.9℃，臨界壓力3.3978 Mpa。只需常溫下將N₂加壓到3.3978 Mpa，或在常壓下將N₂氣降溫到-146.9℃，就可獲得液氮。

       CO₂的Tc為31.1℃，臨界壓力7.3 Mpa。常溫下加壓到6.0 Mpa就可得到液化。液態(tài)CO₂可在-37℃下穩(wěn)定儲(chǔ)存。

       H₂在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下冷卻至Tc -240℃后才能液化，且液氫須在-253℃低溫容器中儲(chǔ)存，生產(chǎn)、儲(chǔ)運(yùn)成本遠(yuǎn)高于液N₂和CO₂。

       液氮生產(chǎn)成本低，液氫儲(chǔ)存使用條件苛刻。液態(tài)CO₂不僅成本較低，重要的是通過添加CO₂將液態(tài)混合氣體的沸點(diǎn)溫度升高，對(duì)提高儲(chǔ)運(yùn)和使用的安全系數(shù)大有裨益。

       實(shí)踐中，厭氧工作站有單一AMG供氣（Single Gas Configuration，SG）和N₂+AMG雙氣體供氣（Two Gas Configuration, TG）兩種運(yùn)行模式。

       工作站運(yùn)行氣體消耗量，與工作站的使用頻率、轉(zhuǎn)移艙內(nèi)部容積大小和物品出入次數(shù)有關(guān)。

       Mini Station、AG300及Basic I這類迷你型、小型厭氧工作站，系統(tǒng)氣路及氣體控制單元結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化，小型化設(shè)計(jì)有利于降低建造和購置成本。小巧的工作艙空間不過130L，單一AMG實(shí)施各艙段氣體置換和厭氧環(huán)境維持的氣體消耗仍十分經(jīng)濟(jì)。據(jù)悉，Mini Station厭氧工作站單一AMG氣體工作模式下，標(biāo)準(zhǔn)40L容量鋼瓶（≥10m³氣體）可持續(xù)供氣多約28周。

       而標(biāo)準(zhǔn)尺寸厭氧工作站，工作艙容積300-500L，轉(zhuǎn)移艙容量40-50L，采用單一AMG氣體運(yùn)行，標(biāo)準(zhǔn)40L氣瓶可持續(xù)供氣2-3周。通常，大容量工作站用戶采用雙氣工作模式的運(yùn)行成本更低。A20、A25、Bactron 200-2等小型工作站以及A35，Bactron 300-2，E400、E500G、LAI-3DT及LAI-3T-N20等標(biāo)準(zhǔn)型厭氧工作站，都采用了雙氣運(yùn)行模式。這類工作站機(jī)身設(shè)有N₂和AMG兩種氣體輸入接口，系統(tǒng)的氣路結(jié)構(gòu)及氣體控制單元相對(duì)復(fù)雜。

       厭氧工作站的PLC控制芯片是根據(jù)O₂傳感器測(cè)試值，基于內(nèi)置算法來通過控制AMG氣體流量來調(diào)控工作艙氧含量。如AMG氣體組成及比例與系統(tǒng)控制標(biāo)準(zhǔn)不匹配，必然危及艙內(nèi)厭氧環(huán)境的安全穩(wěn)定。

       目前，厭氧工作站用的AMG組成比例有兩個(gè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

       英式AMG標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定的氣體組成比例為80%N2+ 10%CO2 + 10%H2。英國DWS的A25和A35，Electrotek 品牌AW200SG與AW300SG，江雪MiniStation、E200、E500系列厭氧工作站即執(zhí)行該標(biāo)準(zhǔn)。

       美式AMG標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定氣體組成比例為5% CO2+5% H2+90%N2。Shellab品牌的Bactron 200-2、Bactron 300-2系列工作站，龍躍LAI-3DT等厭氧工作站沿用該標(biāo)準(zhǔn)。

       實(shí)際工作中，AMG的訂購和使用須嚴(yán)格依具體設(shè)備型號(hào)所執(zhí)行AMG標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

三、結(jié)語

       厭氧工作站是采用小型氣泵按固定流速抽取艙內(nèi)氣樣輸入檢測(cè)單元來測(cè)定和指示艙內(nèi)氧含量情況的。因采樣點(diǎn)、采樣流速和工作艙內(nèi)部容積大小的限制，系統(tǒng)厭氧狀態(tài)指示所反應(yīng)的只是某個(gè)時(shí)段、局部厭氧狀態(tài)，具有時(shí)間上的滯后性和空間局限性，并非工作艙內(nèi)所有位點(diǎn)、所有時(shí)段氧含量的真實(shí)水平。

       而實(shí)驗(yàn)器具（移液器、吸頭、移液管、培養(yǎng)皿、試劑瓶、培養(yǎng)瓶等）及試劑溶液攜氧難以避免。如剛移入工作艙便立即進(jìn)行厭氧操作，這部分輸入性氧分與艙內(nèi)氣體交換，會(huì)造成厭氧狀態(tài)波動(dòng)，但卻難以及時(shí)被系統(tǒng)氧檢測(cè)或指示單元所感知，造成系統(tǒng)除氧反應(yīng)滯后。實(shí)驗(yàn)器具越多，器具用品內(nèi)部充氣空間和溶液體積越大，則輸入性氧成份污染危害越大。

       我們建議，大量站外實(shí)驗(yàn)用品輸入工作艙后，應(yīng)將器具開蓋靜置足夠時(shí)間，確保輸入氧氣釋出、觸發(fā)系統(tǒng)厭氧維持機(jī)制后，再實(shí)施氧敏感樣品的操作。

主要參考文獻(xiàn)

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［5］Anaerobic Workstation AW400TG Two Gas Version Manual
［6］BACTRON Anaerobic Chambers Installation and Operation Manual（Rev. July 8, 2022）