（續(xù):MIQE指南對qPCR實驗中核酸紫外測定的要求-上）

三、實時熒光定量PCR實驗MIQE核酸質控規(guī)則的實際運用

       資料顯示，如同MIQE指南本身在國際學術期刊的文稿發(fā)表審稿環(huán)節(jié)實際貫徹落實情況的遭遇，不同期刊對文章qPCR實驗checklist的要求并不一致。整體上，按文章中對核酸質量控制過程細節(jié)披露的詳略不同，常見3種情形。

3.1用心良苦型

       皮膚淀粉樣變性(Amyloidosis cutis dyschromia, ACD)是主要發(fā)生于東亞和東南亞族群的不完全外顯的常染色體顯性遺傳疾病。糖蛋白非轉移性基因 B (glycoprotein non-metastatic gene B, GPNM-B)編碼的GPNM-B跨膜蛋白，在表皮的黑色素細胞中表達最盛。正常情況下，GPNM B蛋白與自噬蛋白和吞噬小體共定位，參與自噬蛋白被招募到吞噬小體，與溶酶體與吞噬小體融合，促進黑色素小體的形成。ACD個體發(fā)生的基因突變造成GPNMB蛋白分子截斷、在胞質中顯著降解和錯誤細胞定位，導致對黑色素小體的形成、吞噬作用等負調控功能的缺失，造成 ACD中黑色素失調和淀粉樣變。對轉染野生型、突變型GPNM B基因cDNA質粒的HeLa細胞中GPNMB mRNA表達水平檢測證實，突變體GPNMB mRNA的表達水平明顯低于野生型轉錄本。實驗中，NanoDrop 2000（相當于NanoDrop One）被運用于以下操作：

1）從HeLa細胞提取總RNA經(jīng)DNase處理后的總RNA的純度(purity) (A260/A280、A260/A230比值)和濃度 (concentration)測定（A260）。其結果為：A260/A280≥1.9，A260/A230≥2，總RNA濃度386–466 ng/μL；

2）取1μg總RNA（約2-3μL提取液）反轉錄合成cDNA；

3） qPCR反應的cDNA用量：上一步反應合成的cDNA（反轉錄產(chǎn)物cDNA產(chǎn)量和濃度測定值不詳）經(jīng)10倍稀釋后，每孔取2μL稀釋cDNA模板，500 nM正、反向引物組, 2× SYBR Green PCR Master Mix在384孔PCR板上構建10 μL反應體系完成RT-qPCR和溶解曲線分析。

GPNM-B基因外顯子測序樣品的準備過程，同樣采用A260/A280、A260/A230比值檢驗核酸純度（A260/A280≥1.8, A260/A230≥2）、Qubit 2.0熒光染料法測定DNA濃度，還增加1%瓊脂糖凝膠電泳分析步驟以驗證DNA是否存在降解。 

3.2中規(guī)中矩型

       這部分刊文的qPCR實驗，核酸樣品質量評估控制環(huán)節(jié)，一般通過測定260/280、260/230兩項指標來評估所提取的核酸樣品的純度和濃度，測定指標的披露往往被省略。

       由于細胞在3D培養(yǎng)基質支持下懸浮生長比常規(guī)2D體外培養(yǎng)更接近在體內真實環(huán)境生長細胞所具有的形態(tài)、增殖、分化、遷移和基因表達等特征。因此3D細胞培養(yǎng)體系統(tǒng)可用于疾病模型構建、藥物篩選、細胞治療和再生醫(yī)學研究等領域。采用液滴微流控技術在單個細胞的周圍構建起三維水凝膠基質環(huán)境，可精確控制細胞周圍三維凝膠的沉積量。當間充質基質細胞粘附于較薄凝膠時，其體積擴張得更快，具有更高膜張力和增加成骨分化功能。間充質干細胞成骨分化標志性基因表達分析實驗中，RNA質量評估是這的：純化的總RNA被重懸于15μL RNase-free water (注：模擬中性pH環(huán)境)，NanoDrop 測定RNA 的濃度和質量（concentration and quality）；反轉錄采用Superscript-III reverse transcriptase試劑盒；每個qPCR反應孔為50 ng cDNA用量。

       文中沒有披露RNA濃度、質量具體測定指標、測定值、反轉錄RNA用量。但給出cDNA用量，說明作者是測定cDNA的濃度后再根據(jù)吸取體積計算出cDNA含量。

       另一個近紅外光免疫療法(Near-infrared photoimmunotherapy, NIR-PIT)抗腫瘤療效及機制的研究實驗中，用Nanodrop測定260/280、260/230兩項比值對腫瘤組織的總RNA純度和含量(purity and quantity)進行測評；取2μg 的總RNA用含RNase抑制劑的反轉錄試劑盒合成cDNA。

       這說明實驗人員在測定總RNA的A260后，根據(jù)儀器給出濃度（μg/μL）值和移液體積計算出反轉錄總RNA用量。但文中沒有提供實時熒光定量反應的cDNA用量，故無法得知是否進行過cDNA濃度的測定。

3.3 一筆帶過型

       大量qPCR實驗論文中對核酸質量控制過程描述都過于簡略，與MIQE指南的要求相距甚遠。

       胸腺基質淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)可通過激活2型免疫細胞、增加免Treg細胞數(shù)量，誘導皮膚分泌脂肪而減少白脂肪堆積，防止肥胖。2021年發(fā)表于Science上的這篇高作披露：在對皮膚18個與人類皮膚皮脂生成相關基因和TSLP基因表達檢測分析實驗中，用Nanodrop 1000測定了總RNA的含量。

       另一項對新發(fā)現(xiàn)的、與外周血T細胞淋巴瘤(Peripheral T-cell lymphoma, PTCL)復發(fā)有關的嵌合轉錄本（基因融合突變而產(chǎn)生的融合基因表達的mRNA）FYN-TRAF3IP2、KHDRBS1-LCK和SIN3A-FOXO1的研究項目中，qPCR反應前用NanoDrop 2000測定了嵌和轉錄本的濃度和純度。

       磷酸甘油酸激酶1（phosphoglycerate kinase 1, PGK1）是糖酵解過程的關鍵酶。敲除pgk1基因，抑制了細胞的糖酵解反應，導致小分子代謝物甲基乙二醛(MGx)的積聚，進而使PGK1近端半胱氨酸和精氨酸殘基發(fā)生翻譯后的修飾，產(chǎn)生了KEAP1二聚體結構，并伴隨NRF2的積累和NRF2轉錄的激活。揭示了KEAP1-NRF2信號轉導通路在應激反應條件下的細胞代謝功能調控機制。美國斯克利普斯研究所的大V們用慢病毒載體搭載PGK1、GLO1基因靶向shRNA轉染HEK293T細胞進行的基因敲除，靶基因表達驗證實驗部分，用NanoDrop測定總RNA的濃度后取500ng-5μg用于cDNA的合成。

       類似案例不勝枚舉。

       可見，對實時熒光定量PCR反應核酸質量評估環(huán)節(jié)，紫外吸光度評價法的測定指標，業(yè)界認識并不一致。評估方法上重量（Nucleic acid quantification）輕質（Contamination assessment、Purity (A260/A280)）的現(xiàn)象依然十分普遍。

四、討論

       嘌呤、嘧啶、核苷、寡核苷酸或核酸（DNA和RNA）分子因共同的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)共軛雙鍵而具有統(tǒng)一的260nm吸收峰特征。260nm的吸光度與所含DNA和RNA、寡核苷酸（PCR引物、探針）的濃度成正比，這是A260用于核酸定量的基礎。蛋白質肽鏈的色氨酸和酪氨酸殘基具有苯環(huán)含共軛雙鍵，280nm紫外線吸收峰為其標志，故A280被用于蛋白的紫外測定和計算蛋白濃度。

       在pH中性溶液中，dsDNA的A260/A280比值為1.8；ssDNA、寡核苷酸鏈和RNA的A260/A280比值為2.0。而溶液含有蛋白質（如各種核酸酶、蛋白酶、血紅蛋白、免疫球蛋白等）或酚類殘留時，核酸A260/A280比值將低于1.8/2.0。有觀點認為：RNA樣品的A260/A280比值1.9~2.0屬高純度，1.8~1.9視為輕度蛋白污染，但還可以正常使用；但比值<1.8則視為嚴重污染，可能干擾后續(xù)實驗。對于DNA，A260/A280比值＞1.9表明有RNA污染；A260/A280＜1.6，視為蛋白質/苯酚的中度污染。因此，A260測試對應于核酸濃度（concentration）測定，而A260/280比值針對的是核酸純度（purity），用于評估吸收峰波長260nm以上的蛋白、苯酚類污染程度。

       MIQE指南強調A260、A280測定須在pH中性溶液中進行（溶液的pH值改變引起核酸蛋白分子共軛體系的延長或縮短，使紫外吸收峰偏移，測定值相應發(fā)生改變。以RNA溶液為例，酸性環(huán)境下報告的A260/A280值可能比2.0要降低0.2-0.3，而堿性環(huán)境下的測定值則相反。這是造成不同實驗報告中A260/A280、A260/A230比值不同一個不可忽視的重要因素。報告核酸樣品測定結果時，注明測試溶液的溫度和pH值更有參考價值）。眾多文獻中的做法是將核酸溶于不含DEPC、RNase的Thermo Scientific RNase-free water中檢測。而通常，25℃室溫下新鮮超純水pH值約7.0，是最方便的核酸溶劑來源。

4.1 核酸純度評估A260/A280之外是否應引入A260/A230？

       討論這一話題，是因單一A260/A280指標評估核酸純度的準確性業(yè)界一直存有爭議。

       首先，因核酸對250nm-270nm范圍的消光系數(shù)比蛋白質高很多，少量蛋白污染（如人為加入5%蛋白質）對A260/A280比值（處于1.96-1.99區(qū)間）影響有限。只有當?shù)鞍踪|肽鏈中色氨酸殘基（吸收峰為280nm）比例較高，蛋白的混入才會出現(xiàn)A260/A280比值顯著改變。純蛋白樣品A260/A280比值為0.57，而只需少量核酸混入即可使比值迅速躥升至1.0上下。因此，A260/A280比值最適于對蛋白制品中核酸污染評估，作為指示核酸樣品中蛋白污染程度并不靈敏。

       其次，苯酚、異硫氰酸胍、PEG等提取試劑、雜質，在230nm、260nm、280nm波長附近均有不同程度光吸收，增加A230、A260和A280測定值，會干擾A260/A280比值。譬如苯酚殘留，不僅使A230、A260和A280讀數(shù)上升。同時，因其吸收峰與核酸吸收峰合并后整體遷移移至270nm附近。表面上樣品 260/280 比值接近正?；蚪档?，但樣品吸收峰出現(xiàn)在270nm，且存在260/230比值降低現(xiàn)象，實際存在苯酚殘留。再如胍鹽、糖原和碳水化合物等，有230nm的吸收峰，雖不影響A260、A280讀數(shù)及260/280比值，但會壓低260/230比值。此時樣品260/280值達標，但260/230<1.6，污染是存在的。

       盡管因DNA、RNA樣品A260/A280比值不同，理論上，基因組DNA殘留會使RNA的比值低于2.0。但基于上述各種復雜情況，僅憑A260/A280比值是無法有效確認樣品提取過程中基因組DNA的污染及嚴重程度的。因此，單一A260/A280比值實現(xiàn)對核酸純度，特別是核酸抑制劑污染的評估，是不全面的。

       克服A260/A280單一指標缺陷的有效辦法是核酸樣品波長掃描分析。以RNA為例，純RNA掃描得到的是一平滑曲線：有A230波谷、A260波峰，A320\A340貼近背景基線；A260/A280≈2.0，A260/A230≈2.0，A260/A215≈1.0。

       部分固定波長的微量紫外光度計，如賽默飛的NanoDrop Lite Plus微量紫外光度計(A230/A260/A280)，無法進行全波長掃描，可用A260/A280、A260/A230雙比值來評估污染物的殘留情況。

       事實上，本文所引文獻中就有實驗采用的是A260/A280 +A260/A230雙比值法。這比SPUD抑制劑測定法，顯然更加快捷、經(jīng)濟易行。

4.2 如何評估RNA樣品中基因組DNA污染？

       qPCR實驗中，反轉錄合成的cDNA與殘留的基因組DNA都可作為PCR模板被擴增，特別是采用SYBR Green染料標記的測試中，殘留的DNA熒光信號污染會影響定量數(shù)據(jù)準確性。因此，去除總RNA中的基因組DNA污染，對于采用RT-qPCR方法進行基因表達定量分析具有特殊必要性。

       而完全依賴A260/A280單一指征對核酸污染評估確有潛在風險。

       由于基因組DNA分子量通常比RNA分子量大得多，在凝膠電泳中遷移率存在明顯差異，因此可通過瓊脂糖凝膠電泳予以有效分離和鑒定。通常，總RNA中如有基因組DNA殘留，DNA條帶因為遷移緩慢而滯后于所有RNA條帶，在凝膠上表現(xiàn)為在28S rRNA帶上方、接近上樣孔附件出現(xiàn)新的彌散條帶。MIQE指南規(guī)定，須記錄實驗中對RNA樣品經(jīng)何種DNase酶及處理條件這一細節(jié)。同時建議實驗者提供反轉錄操作前樣品的凝膠電泳分析證據(jù)。

       增加瓊脂糖凝膠電泳分析，不僅簡便易行，還增進核酸質量評估的嚴謹性和測試結果可靠性。盡管在MIQE指南屬于核酸提取操作中D類審查事項，但本文所引用多篇刊文的實驗中都采用了該方法。

       A260/A280比值之外，MIQE指南要求記錄（測試所用具體方法流程）可耐受基因組DNA污染含量的閾值（the threshold cutoff criteria for the amounts of such contamination that are tolerable.），并報告每個測試靶標核酸樣品孔、陽性對照樣品（內參對照基因）孔和無逆轉錄對照孔（只有RNA而無cDNA，可檢驗RNA樣品在經(jīng)DNase處理后中是否還有基因組DNA的殘留）的Cq比較結果（the results from a comparison of Cqs obtained with positive and no-reverse transcription controls for each nucleic acid target.）以證明是否存在基因組DNA污染干擾情形。

4.3 簡便易行的核酸樣品PCR抑制劑評估建議

       核酸質量評估控制環(huán)節(jié)還有一審查事項就是PCR抑制劑污染的評估。

       無論是MIQE指南與人們實際工作中執(zhí)行的做法是一致的，即采用核酸樣品連續(xù)倍比稀釋，根據(jù)qPCR標準曲線所計算的PCR擴增效率來證明是否存在PCR抑制劑污染。

       A260/A280 +A260/A230雙比值，可視為PCR抑制劑評估的間接證據(jù)。

4.5 MIQE指南紫外吸光度法核酸質量評價環(huán)節(jié)是否有值得商榷之處？

       首先，MIQE checklist表中反轉錄步驟，用Amount of RNA（RNA質量，即μg或ng質量數(shù)）及Priming oligonucleotide concentration都屬于必須報告內容，對qPCR反應cDNA/DNA模板用量不作要求，這不合理。因為cDNA轉錄效率存在一定程度的基因特異性、反應時間依賴性和各廠家試劑盒合成效率差異化的事實，相的總RNA用量、RT酶和RT時間，cDNA合成產(chǎn)量存在差異是完全可以預料的，這勢必導致稀釋后上樣的cDNA輸入量不同，再考慮到不同qPCR儀擴增性能不一致，不明確cDNA起始用量，實驗結果的可重復性和穩(wěn)定性就是空話。而現(xiàn)實情況是，大量刊文中都標明qPCR反應起始核酸模板用量的做法。

       其次是關于核酸品質紫外評估方法的問題。不僅A260/A230比值是否應該引入問題。對于Contamination assessment (DNA or RNA)與Purity (A260/A280)的內涵與聯(lián)系，MIQE也欠一個說明的。從指南原文看，核酸污染評估指的是一種核酸（如RNA）中有另一種核酸(如基因組DNA)的少量殘留污染，并且認為A260/A280比值(Purity測定指標)下降可認定RNA樣品中存在DNA污染。如果Contamination assessment（E類）可用A260/A280比值變化（D類）來準確評估，那把二者分別劃為E、D，本身自相矛盾。除非諸如從微量紫外可見光度計吸光度測定、瓊脂糖凝膠電泳、熒光染料法、Agilent 2100 Bioanalyzer, Qiagen QIAxcel等中找到了比A260/A280比值更可靠、簡便、經(jīng)濟的方法，否則，作為一個標準體系，Contamination assessment (DNA or RNA)的可執(zhí)行性、嚴肅性難免要大打折扣。

        目前無論是綜合應用類常規(guī)紫外可見分光光度計（如日立UH5300等），抑或生物學核酸蛋白測定用紫外可見光度計（如eppendorf BioPhotometer Plus、NanoDrop One系列、Implen NanoPhotometer N50及Nano 100/Nano 300等），系統(tǒng)預置的核酸測定工作協(xié)議中，A230、A260、A280、A260/A230A和260/A280指標早已用作行業(yè)標準。

       足見在核酸質量評價具體指標的問題上，MIQE指南這把寶刀的確有個豁口。

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