應用驅(qū)動型qPCR儀選型攻略-4

       1991年，美國Cetus公司發(fā)明了利用Taq酶5'外切酶活性水解與模板雜交的寡核苷酸探針的方法，并命名為“TaqMan”（據(jù)說靈感源自一款叫“Pacman”吃豆人的電子游戲名)。該5’核酸酶處理技術連同PCR核心方法專利權(quán)隨著Roche并購Cetus后歸Roche Molecular Systems所有。

        墻內(nèi)開花墻外香。 

       Applied Biosystems公司將5' -3'核酸酶降解法與熒光能量轉(zhuǎn)移技術（FRET）結(jié)合，開發(fā)了用reporter dye (FAM) + quenching dye (TAMRA)雙色熒光標記的探針信號系統(tǒng)，并與Genentech、Roche協(xié)作在ABI Prism 7700 Sequence Detector上驗證取得成功。受益于PCR儀開發(fā)基礎和專利保護，ABI實時定量PCR儀很快就占據(jù)行業(yè)領導地位，并極大推動了Taqman探針檢測的廣泛應用。

        Taqman探針技術炙手可熱，肥水不流外人田。 

       不甘躺平數(shù)錢（全球PCR和Taqman探針技術專利授權(quán)版稅）的羅氏，于是另起爐灶弄出個毛細管離心式模塊實時定量PCR儀，既要兼容各家不同熒光報告基團標記的Taqman探針，又能給自家兩個冷貨——雙雜交探針（HybProbe Probes）和單探針（SimpleProbe Probes）帶貨。這在1999-2003年開發(fā)的LightCycler系統(tǒng)上表現(xiàn)尤為突出。

 表1 Detection Format for the LightCycler Instrument 

        LightCycler 1.2和改進后的LightCycler 1.5均為3檢測通道布局：一個5’-核酸酶水解探針檢測通道（FAM/SYBR Green I）、2個HybProbe Probes 探針（Red 640和Red 710）專用通道。LightCycler用于常規(guī)定量分析還好辦，若要開展SNP基因分型探針實驗，就只能用羅氏獨門暗器。

        LightCycler 2.0系統(tǒng)的檢測通道數(shù)增加到6個，其中有2個水解探針信號通道（FAM/SYBR Green I、HEX/VIC）。另外4個是清一色FRET專用通道，用于Red 610、Red 640、Red 670和Red 710探針的檢測。沒有對比就沒有傷害。測試通道多了固然可解決常規(guī)單重定量、多重定量和基因分型實驗問題，但封閉毛細管耗材外加高冷專利探針售價，LightCycler 2.0依然飽受詬病。從LightCycler 1.2到LightCycler 2.0，羅氏雖一直在追趕ABI PRISM 7700，就是沒有實現(xiàn)超越。

       將羅氏從高級腹黑形象中拉出半個身子的是LightCycler 480。

       2005年，羅氏部分PCR核心專利到期，與ABI就定量PCR專利一通利益交換后，羅氏首款采用金屬熱循環(huán)模塊的LightCycler 480面世，并于2008升級為LightCycler 480 Instrument II。這是羅氏脫掉紳士禮服要光著膀子上陣搶大餅的節(jié)奏。

        人們洶涌澎湃的qPCR實驗習慣，逼著羅氏放下身段，走了一條水解探針與雙雜交探針并重的技術路線。LightCycler 480實時熒光定量PCR儀是6個通道設計，但采用的是3個水解探針通道+3個FRET專用通道的1:1方案，裁掉了LC Red 705 FRET通道，新增一個LC Cyan 500水解探針通道。最關鍵的是，通過新增的533nm、618nm兩種激發(fā)光源，可以直接檢測采用LC Red 610、LC Red 670標記的水解探針信號。

        LightCycler 480 II的檢測應用模式中，除SNP檢測在力推FRET雙雜交探針，Endpoint Genotyping 、Quantification應用提供的是常規(guī)水解探針方案。

        嘗試通過檢測通路的技術融合來提升平臺功能和兼容性的，絕非羅氏一家，且已然成了實時熒光定量PCR儀檢測通路技術發(fā)展的一個趨勢。

        伯樂公司，既沒有控制PCR儀核心專利，也與TaqMan探針、FRET雙雜交探針專利無緣。然而，CFX96 real-time PCR detection system別出心裁，在TaqMan探針檢測功能之外引入了FRET探針專用檢測通道，系統(tǒng)編程中專門提供了FRET模式選項。這樣的拿來主義，既鞏固了自身鐵粉，又可從ABI、羅氏的飯圈挖墻腳。從CFX9、CFX384開始，到CFX96-Touch、CFX384-Touch，直至最新CFX Opus 96、CFX Opus 384實時熒光定量PCR儀，概莫如此。

       也是在2010年前后，ABI一改沿用十余年的光學耦合檢測通道技術，開發(fā)了Enhanced OptiFlex System（增強型OptiFlex 光學系統(tǒng)）并率先應用于ViiA 7實時熒光定量PCR儀。這個OptiFlex光路系統(tǒng)到底亮點在哪？

       傳統(tǒng)qPCR熒光檢測通路中，一旦設定探針為VIC標記染料，系統(tǒng)自動驅(qū)動520nm/560nm這對光學濾鏡進入檢測工位。

       OptiFlex光路單元有6個激發(fā)濾片和6個發(fā)射濾片工位，但激發(fā)、發(fā)射過濾組件不再是固定耦合關系，是各自獨立?？筛鶕?jù)探針標記染料光學特征，可任意將發(fā)光濾鏡、發(fā)射光濾鏡組成臨時檢測通道，還也可以出廠定制特殊激發(fā)、發(fā)射濾鏡。ABI宣稱OptiFlex系統(tǒng)可兼容21種常見染料，可使多重熒光檢測等應用中熒光染料的選擇具有更大靈活性。其實，拋去華而不實和矜持，OptiFlex的設計初衷恐怕有點瞄準羅氏FRET探針檢測的成份。 

       羅氏探針難道真的可以在搭載了OptiFlex光學通路的ABI實時熒光定量PCR儀上檢測嗎？這是個好問題。 

       FRET雙雜交探針中的Acceptor，如LC Red 610、LC Red 640、LC Red 670、Cy5等，本質(zhì)就一個普通熒光信號Reporter。并非只有498nm激發(fā)光源和通過Donor-Acceptor能量FRET這一種檢測途徑，還可以直接用533nm、580nm、618nm激發(fā)光源和相應的610nm、640nm、705nm熒光濾鏡采集熒光信號。選擇與FRET探針檢測匹配的激發(fā)、發(fā)射濾光片有機組合固然可以實現(xiàn)HybProbe Probes完美檢測。而繞過FRET機制中的Donor熒光素，直搗黃龍激發(fā)探針的reporter熒光基團和檢測，可行性是毫無疑問的。 

表2 Filter Set of the LightCycler 480 Instrument 

        LightCycler 480 Instrument II僅用498nm、533nm、618nm三個激發(fā)濾鏡與610nm、640nm、660nm、670nm四個發(fā)射熒光濾光片即組成了FRET探針檢測標準解決方案。這對于激發(fā)、發(fā)射模塊可自由組合的OptiFlex光路系統(tǒng)而言，構(gòu)建相似方案絕非難事。  

表3 Instrument filters and supported dyes 

        ABI的ViiA7 、QuantiStudio 5（QS 5）、QuantiStudio 7 Pro （QS 7 Pro）、QuantiStudio 7 Flex （QS 7 Flex）和QuantiStudio 12 Flex實時熒光定量PCR儀，標準配置為非藕聯(lián)的光學測通道配置（decoupled six-by-six-color filter set），可以輕松完成Ex498 nm/Em623 nm(LC Red 610、LC Red 640)，Ex498 nm/Em682 nm(LC Red 670、Cy5)和Ex498nm/Em711 nm(LC Red 705、Cy5.5)的FRET探針光學檢測通路的組建。 

       另外，F(xiàn)ERT探針熒光信號采集的時間點是在探針與擴增片段結(jié)合階段，即退火/復性階段。這與ABI默認退火/延伸階段信號采集設置是一致的。 

      FRET雙雜交探針通道數(shù)據(jù)采集持續(xù)約10-46ms。如果QuantiStudio 系列平臺與ABI Prism 7700熒光定量PCR儀CCD默認曝光時間基本一致（即25ms，有待核實），而CCD的分辨率、動態(tài)監(jiān)測范圍、信號檢測靈敏度等技術指標接近或優(yōu)于LightCycler 480檢測單元相關參數(shù)，同樣符合測試要求。 

表4 LightCycler Instrument’s Specifications for the Detection System

       因此，參考LightCycler 480相應檢測通道設置，立足于現(xiàn)有的QS5、QS7、QS 12和ViiA7實時熒光定量PCR儀進行FRET探針信號檢測的嘗試與探索，在特殊條件下，是有積極意義的。 

       自從有了ViiA7，或更準確點說是打用上解藕聯(lián)式（decoupled color filter set） OptiFlex光學通道，ABI定量PCR儀用戶再也不用為FRET檢測發(fā)愁了。 

參考文獻

[1] P. Mickey Williams. The Beginnings of Real-Time PCR. Clinical Chemistry, 2009; 55:4833–834

[2] LightCycler 480 Instrument Operator’s Manual Software Version 1.5

[3] LightCycler 1.5 Instrument Operator’s Manual (Version 1.0)

[4] LightCycler 2.0 Instrument Operator’s Manual A (Software Version 4.1)

[5] ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User′s Manual (904989B, 01/2001)

[6] QuantStudio 3 and 5 Real-Time PCR Systems Installation, Use and Maintenance (Revision C.0)