（前續(xù)：Optima Max-xp超速離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的選擇對外泌體分離效果影響的分析）

       用差速離離心方法從不同功能狀態(tài)活細(xì)胞群來源的細(xì)胞外囊泡群中分離外泌體，是常用的的外泌體分離方法。差速離心的實現(xiàn)依賴于樣品顆粒的沉降屬性。在設(shè)定的RCF環(huán)境下，離心機(jī)轉(zhuǎn)頭內(nèi)部RCF分布不均衡，多數(shù)情況下，離心沉淀組分中，均不止直徑40-150nm的外泌體，往往還夾雜直徑100-300nm的其它EVs組分。離心沉淀中組分構(gòu)成不同，是導(dǎo)致不同研究數(shù)據(jù)差異的重要原因。不同離心時間，樣品管內(nèi)不同大小、組成、密度的顆粒發(fā)生共沉淀難以有效避免。研究表明，沉淀物中外泌體和脫落囊泡比例、非囊泡類生物大分子的構(gòu)成比例有時間依賴性。
目前，對外泌體的發(fā)生起源、功能作用尚處于探索階段。超速離心時間的設(shè)定，在實踐中尚無嚴(yán)格統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。而超速離心時間選擇，不僅關(guān)乎實驗結(jié)果的可重復(fù)性，還對整體實驗工作進(jìn)程有直接影響。我們有必要來探討外泌體分離流程中的超速離心時間如何設(shè)置這一復(fù)雜問題。

1、外泌體分離中影響時間設(shè)定的轉(zhuǎn)頭因素

       樣品離心沉淀所需時間（沉降時間）主要由樣品組分在特定條件下的沉降系數(shù)、工作轉(zhuǎn)速和特定轉(zhuǎn)頭的Rmax與Rmin比值三個因素決定。用公式可表述為： 

T_s = (1/S) ? (1/ω² ) ? ln(R_max/R_min)  ······················································· (9)

       規(guī)定K因子值的定義后，公式(9)可轉(zhuǎn)變?yōu)椋?/span>

T_s = k/S   ······················································································· ·················· (10)

       樣品組分的沉降屬性與自身密度、溶液溫度和粘度有關(guān)。高濃度蔗糖溶液、添加血清的培養(yǎng)基環(huán)境下，細(xì)胞外囊泡、細(xì)胞器沉降速度會降低。

       公式(10)表明：在樣品條件相同情況下，離心時間長短與所用轉(zhuǎn)頭的k因子值大小有關(guān)。K因子小，沉降時間短；K因子值大，沉降時間長。
有研究證實：水平轉(zhuǎn)頭之間，根據(jù)轉(zhuǎn)頭各自有效k因子值的對比關(guān)系來優(yōu)化調(diào)整有效離心時間，可取得較一致的分離結(jié)果。但此方法不適用于角轉(zhuǎn)頭之間離心時間的調(diào)整。
       外泌體超速分離中，為確保溶液中樣品回收率同時兼顧離心工作效率，運(yùn)用轉(zhuǎn)頭K因子值與沉降時間的關(guān)系原理，調(diào)整離有效離心時間是意義的：對R_min較小的轉(zhuǎn)頭宜適度延長離心時間；若采用相同離心時間設(shè)置，則可嘗試將R_min小的轉(zhuǎn)頭宜適度提高RCF值，如從100000×g調(diào)整為110000×g。
       以單管容量均為39mL的MLA-50與Type 70 Ti兩個轉(zhuǎn)頭為例：Type 70 Ti的R_min和RCF_min大、K因子值小，故分離效能高于MLA-50。如參考方案是Type 70 Ti轉(zhuǎn)頭100000×g下離心70分鐘設(shè)置，則多半采用快速升降速模式設(shè)置。要用MLA-50轉(zhuǎn)頭來替代則離心時間應(yīng)適度延長。反之，若參考方案為MLA-50轉(zhuǎn)頭，而采用Type 70 Ti轉(zhuǎn)頭進(jìn)行，則延長離心時間不必延長。
       離心時間設(shè)置，不能僅考慮樣品組分有效沉降時間，還須結(jié)合實際所用轉(zhuǎn)頭升降速過程占用時間的差別。

        轉(zhuǎn)頭運(yùn)行時間分為啟動加速、穩(wěn)定運(yùn)行和剎車減速三個階段。而樣品有效沉降時間只相當(dāng)于剔除加速、減速兩個階段后轉(zhuǎn)頭持續(xù)穩(wěn)定在設(shè)定轉(zhuǎn)速或RCF狀態(tài)運(yùn)行的時間。超速離心的設(shè)定時間，除了樣品所需的有效沉降時間，還需將轉(zhuǎn)頭加減速階段耗費(fèi)時長納入考慮。即：超速離心設(shè)定時間要大于樣品沉降所需時長。
        不同型號超速轉(zhuǎn)頭的自重不同、空載與滿載情況下，轉(zhuǎn)頭加減速過程所需時間不同。轉(zhuǎn)頭負(fù)重大，加減速耗時長。此外，設(shè)定的工作轉(zhuǎn)速高，加減速耗時長，則設(shè)定離心時間要相應(yīng)延長（見表7）。

表7  Beckman Optima臺式、立式超離轉(zhuǎn)頭滿載情況下加速、減速時長列表

（工作轉(zhuǎn)速值參考離心力-轉(zhuǎn)速在線換算工具h(yuǎn)ttps://novopro.cn/tools/g-force-rpm-convertion.html計算結(jié)果得出）。

       數(shù)據(jù)顯示，轉(zhuǎn)頭滿載并以最快速度加減速時，多數(shù)轉(zhuǎn)頭加速慢而減速快。
       但最快升降速模式并不適用于所有轉(zhuǎn)頭類型、離心管、樣品載量和應(yīng)用方法。無論角轉(zhuǎn)頭或水平轉(zhuǎn)頭，使用無蓋開口管且樣品滿載狀態(tài)下，啟動和剎車宜盡量平緩以避免啟動剎車過猛引發(fā)樣品外溢損失。而用垂直轉(zhuǎn)頭、近垂直轉(zhuǎn)頭和角轉(zhuǎn)頭密度梯度離心，平緩減速或轉(zhuǎn)頭自由減速，可避免已完成分離梯度液層混合風(fēng)險。

       Beckman超離心內(nèi)置有超平穩(wěn)控制功能（Ultra Harmonic Technology, UHT），是通過內(nèi)置UHT程序控制轉(zhuǎn)頭升降速的速度變化曲線。以Optima MAX-XP為例，加減速過程設(shè)置有10檔升、11檔降的UHT控制程序可選（見表8）。

表8 Acceleration and Deceleration Rates

       加速ACCEL控制程序分別用數(shù)字1-9和無數(shù)字表示共10檔，而減速DECEL控制程序分為0-9和無數(shù)字共11檔。超速離心的加減速過程控制各分為兩個階段：0-5000rpn階段和5000rpm – 設(shè)定轉(zhuǎn)速階段。無論升速、降速，5000rpm-工作轉(zhuǎn)速階段，系統(tǒng)均以系統(tǒng)默認(rèn)的最快速度進(jìn)行不受人工干預(yù)。而0-5000rpn低速階段，則由ACCEL\DECEL程序調(diào)控。數(shù)字代碼從1至9，轉(zhuǎn)頭升降速的時間以30秒-1分幅度遞增。1檔較短，9檔最長。0檔為自由落體式減速耗時超過10分鐘。不輸入檔位代碼數(shù)字，則轉(zhuǎn)頭從0-設(shè)定轉(zhuǎn)速的全過程均以最快變速完成升降速過程。

       數(shù)據(jù)表明，僅0-5000rpm這一過程一升一降兩個階段各取中位數(shù)累計時間就長達(dá)5分半鐘。再將5000rpm至設(shè)定工作轉(zhuǎn)速（如設(shè)定為30000rpm）最快變速階段時間，則升降速過程耗時至少在7分鐘以上。這一點從表7提供的轉(zhuǎn)頭升降速時間看，實際超過10分鐘。

       因此，為確保樣品有效離心時間不低于60分鐘，“基礎(chǔ)流程1”建議在滿足100000×g RCF的條件下超離時間設(shè)置為60+N分鐘，N值大小對應(yīng)的正是轉(zhuǎn)頭的加減速時長。

2、外泌體超速分離流程中離心時間設(shè)置存在的爭議
        在已報道的63個實例中，27例的時間設(shè)置為70-90分鐘，多達(dá)16例的設(shè)置為120分鐘，3例為3小時，還有1例是4小時的設(shè)置。其中，轉(zhuǎn)頭型號可查實的37例中，所用轉(zhuǎn)頭與時間設(shè)置情況見表9。表中編號213、229、106、273的不同實驗，工作溫度、緩沖液、轉(zhuǎn)頭（TLA-100.3）、主機(jī)和RCF設(shè)置都相同，而離心時間竟出現(xiàn)了120 min、240 min、60 min和70 min四種設(shè)置。

表9 部分文獻(xiàn)中外泌體超速離心時間設(shè)置與轉(zhuǎn)頭工作參數(shù)表

       表中相同RCF設(shè)置下，離心時間60--120min不等的現(xiàn)象極為常見。可見，關(guān)于離心時間設(shè)置問題，學(xué)界并無一致意見。

       不同實驗項目中，造成離心時間差異懸殊，是由實驗樣品本身和外部離心條件的內(nèi)外因綜合作用的結(jié)果。

       首先是外因方面，不同型號轉(zhuǎn)頭、相同RCF設(shè)置下分離效能存在區(qū)別是不爭的事實(見表10)。單管樣品容量均為39mL的5款轉(zhuǎn)頭TYPE 70 Ti、TYPE 50.2 Ti、VTi 50.1、SW 32 Ti和SW 28之間，在相同118000×g的RCF設(shè)定下，離心效能最高是VTi 50.1，其次是TYPE 70 Ti、TYPE 50.2，水平轉(zhuǎn)頭SW 28墊底。若TYPE 70 Ti有效離心時間為60分鐘，從k因子值大小這一常識即可推定SW 32 Ti和SW 28連個水平轉(zhuǎn)頭有效離心時間遠(yuǎn)超60分鐘。

表10 不同類型轉(zhuǎn)頭在118000×g RCF設(shè)定下轉(zhuǎn)速-K因子值-沉降時間表

       具體實驗中，如SW 32 Ti轉(zhuǎn)頭4小時離心時間收獲的樣品組分與TYPE 70 Ti轉(zhuǎn)頭70分鐘、VTi 50.1離心50分鐘外泌體產(chǎn)量達(dá)到了相同分析效果是極為正常的。另外，衡量外泌體產(chǎn)量的所用方法同樣十分關(guān)鍵。提取離心沉淀中總RNA含量用Bioanalyzer 2100檢測而非實時熒光定量PCR方法，其測試數(shù)據(jù)特異性存疑。Western Blot無法區(qū)分體積較大的細(xì)胞外囊泡、凋亡體、外泌體以及死亡細(xì)胞解體所釋放的TSG101蛋白。

       “基礎(chǔ)流程1”提到了離心3個小時無損外泌體囊泡結(jié)構(gòu)。所謂過猶不及，離心時間并非越長越好。延長離心時間，將使富含蛋白質(zhì)的囊泡顆粒及可溶性蛋白質(zhì)等非囊泡類組分的聚集沉淀，加劇外泌體中蛋白污染程度。對此，目前學(xué)界的看法是有共識的。因此，外泌體含量評價方法存在缺陷情況下界定的外泌體產(chǎn)量，不足為據(jù)。

      其次，外泌體的分泌是一動態(tài)過程，它與細(xì)胞自身功能狀態(tài)、培養(yǎng)基中自帶外泌體排空以及培養(yǎng)條件密切相關(guān)。不同實驗所用細(xì)胞自身活性、功能狀態(tài)以及培養(yǎng)處理條件的差別，造成細(xì)胞外泌體的分泌效率存在區(qū)別。若無細(xì)胞生理功能狀態(tài)特定指標(biāo)的支持，僅憑培養(yǎng)基中細(xì)胞數(shù)量基數(shù)評估外泌體提取產(chǎn)量，結(jié)果值得商榷。

       不應(yīng)輕易得出外泌體分離時間以4小時之內(nèi)為宜，70分鐘離心時間無法分離出外泌體無效的結(jié)論。

       特定 RCF設(shè)置下外泌體離心時間、囊泡直徑大小截止范圍（cut-off）的技術(shù)工具的出現(xiàn)以及大量文獻(xiàn)實例證據(jù)，都不足以支持70分鐘離心時間無效的觀點。

3、外泌體超速分離離心時間的設(shè)置原則與方法
       關(guān)于外泌體超速離心分離流程細(xì)節(jié)信息的匯報，MISEV2018指南除了要求披露實驗所用轉(zhuǎn)頭型號、樣品管、RCF設(shè)置、k因子有效值、離心時間和離心溫度等要素，還需提供轉(zhuǎn)頭加減速設(shè)置參數(shù)。可見，離心時間設(shè)置離不開所用的樣品體積、轉(zhuǎn)頭工作性能條件。
       轉(zhuǎn)頭的選擇需要遵循兩個原則：
1）研究對象相似
       不同來源樣本材料、不同生理病理狀態(tài)下的細(xì)胞分泌的外泌體種類、數(shù)量存在差異。因此，從初始樣品材料相同或相近的外泌體研究參考文獻(xiàn)中，篩選出對超速離心流程的離心時間、RCF設(shè)置、溫度和轉(zhuǎn)頭型號、離心管貨號及轉(zhuǎn)頭加減速信息披露完整的實例，摘錄其實驗參數(shù)條件。其中，離心時間、RCF設(shè)置和轉(zhuǎn)頭型號信息必不可少。
2）轉(zhuǎn)頭性能相近
       當(dāng)轉(zhuǎn)頭型號與參考方案中不一致時，按轉(zhuǎn)頭型號——類型——樣品容量的優(yōu)先順序，選擇與參考轉(zhuǎn)頭效能匹配的超離轉(zhuǎn)頭。
       外泌體超速分離實驗中，不可脫離自身條件，簡單照搬參考文獻(xiàn)的時間參數(shù)設(shè)置。這不僅浪費(fèi)資源和時間，還可能危及外泌體分離結(jié)果。工作參數(shù)優(yōu)化調(diào)整方法，可參考《Optima MAX-XP超速離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的選擇對外泌體分離效果影響的分析》中“根據(jù)轉(zhuǎn)頭工作效能確定外泌體超速離心分離解決方案”一節(jié)內(nèi)容。
       工作參數(shù)的調(diào)整有兩個途徑。一是優(yōu)化離心時間，二是優(yōu)化RCF設(shè)置。
       當(dāng)RCF值明確后，為確保樣品回收率和離心效率，對R_min小的轉(zhuǎn)頭宜適度延長離心時間。以O(shè)ptima MAX-XP臺式超速離心機(jī)用的MLA-50與Optima XE -90立式超離用Type 70 Ti為例。雖然均為單管容量39mL的角轉(zhuǎn)頭，但相同RCF設(shè)置下，Type 70 Ti具有較大R_min、RCF_min和較小K因子值，其分離效能高于MLA-50。如參考方案為Type 70 Ti轉(zhuǎn)頭4℃下100000xg離心70分鐘設(shè)置，用MLA-50轉(zhuǎn)頭替代時，離心時間適當(dāng)延長是必要的。反之，若參考對象是MLA-50，而實驗者用Type 70 Ti，則延長離心時間意義不大。
       外泌體分離的品質(zhì)與轉(zhuǎn)頭內(nèi)部RCF分布有關(guān)。為確保離心管內(nèi)RCF條件接近，考慮到MLA-50和Type 70 Ti之間R_min的巨大差異，單純用相同RCF設(shè)置不夠，還應(yīng)考慮將MLA-50轉(zhuǎn)頭RCF_min調(diào)整至與Type 79 Ti相近的水平。計算表明，Type 70 Ti轉(zhuǎn)頭若設(shè)定為100000xg RCF，則將MLA-50轉(zhuǎn)頭的RCF設(shè)置提升至123600×g后，兩個轉(zhuǎn)頭中離心管的中上部位RCF的分布條件比較接近，有助于獲得與Type 70 Ti轉(zhuǎn)頭接近的分離效果。

(后續(xù)：臺式超速離心機(jī)Optima Max-XP在外泌體分離操作細(xì)節(jié)匯報中應(yīng)注意的問題)