(前續(xù)：Optima MAX-XP臺(tái)式超離在外泌體分離中的主要應(yīng)用類型)

       《Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids》一文（即“基礎(chǔ)流程1”，可參考《外泌體超速離心分離法基礎(chǔ)操作流程 (譯稿)》）中列出了多款適用于外泌體分離的立式、臺(tái)式超速離心轉(zhuǎn)頭。
        其中，立式超速離心機(jī)適用的轉(zhuǎn)頭有：

       水平轉(zhuǎn)頭SW 41 Ti（6×13.2 mL）；

       水平轉(zhuǎn)頭SW 40 Ti（6×14.0 mL）；

       水平轉(zhuǎn)頭SW 32 Ti（6×38.5 mL）；

       水平轉(zhuǎn)頭SW 28 Ti（6×38.5 mL）；

       角轉(zhuǎn)頭Type 70 Ti（8×39 mL）；

       角轉(zhuǎn)頭Type 45 Ti（6×94 mL）。

       臺(tái)式超速離心機(jī)適用的為：

       角轉(zhuǎn)頭TLA-100.3（6×3.5 mL）；

       角轉(zhuǎn)頭TLA-110（8×5.1 mL）。

       單管容量39mL、94mL的角轉(zhuǎn)頭用于對(duì)大量CM培養(yǎng)基自帶外泌體的排空處理。38.5mL容量轉(zhuǎn)頭常被用來(lái)替代高速離心轉(zhuǎn)頭執(zhí)行10000×g下細(xì)胞碎片/較大微囊泡/凋亡小體沉淀的任務(wù)。SW 41 Ti和SW 40 Ti水平轉(zhuǎn)頭主要用于13.5mL體積上清的第一輪100000×g離心操作。
初始材料體積在5mL以內(nèi)的分離實(shí)驗(yàn)，則在臺(tái)式超離上用3.5 mL、5.1 mL兩種轉(zhuǎn)頭完成兩輪超速離心、密度梯度純化分群處理。相較于1.5mL、2.0mL的微量管，3.5 mL、5.1 mL兩種超速離心管的管身長(zhǎng)，梯度液柱長(zhǎng)，特別是對(duì)包含多個(gè)密度組分梯度純化操作中，各密度餾分間距較大，收集時(shí)對(duì)移液操作的精細(xì)程度降低，更方便。其次，這兩款轉(zhuǎn)頭分離效能高，且可完美兼容1.5 - 2.0mL超速管，故使用上更高效靈活。

1、在外泌體超速離心分離流程中轉(zhuǎn)頭的使用方法

       對(duì)應(yīng)初始材料體積5mL以內(nèi)的實(shí)驗(yàn)流程，可在臺(tái)式超離上借助于3.5 mL、8×5.1 mL轉(zhuǎn)頭完成兩輪超速離心、密度梯度純化分群處理（相較于1.5mL、2.0mL的微量管，3.5 mL和5.1 mL超速管，管身長(zhǎng)，梯度液柱長(zhǎng)，特別是對(duì)包含多個(gè)密度組分梯度純化操作中，餾分分布間距較大，收集組分時(shí)對(duì)操作精細(xì)程度降低，更為方便。其次，是所列這兩款轉(zhuǎn)頭分離效能高，且可完美兼容1.5 - 2.0mL超速管。故使用上更加高效靈活）。

調(diào)研收集的63個(gè)外泌體分離應(yīng)用實(shí)例中，明確注明超離轉(zhuǎn)頭型號(hào)、可查實(shí)轉(zhuǎn)頭型號(hào)的為37例。所用轉(zhuǎn)頭單管容量最小1.5mL（LTA-55），最大94mL（Type 45 Ti）。

       多數(shù)報(bào)道用Optima MAX-XP臺(tái)式超離單一轉(zhuǎn)頭完成外泌體分離。譬如，對(duì)腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體分離實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞外液經(jīng)歷500×g離心10分鐘、2000×g離心10分鐘和10000×g離心45分鐘后。用MLA-130角轉(zhuǎn)頭4℃下120000×g離心上清70分鐘完成外泌體分離。在對(duì)源自年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)患者特異性視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE）攝取細(xì)胞外囊泡（AMD RPE EVs）的共聚焦顯微分析實(shí)驗(yàn)中，將事先分離獲得的20μL AMD RPE EVs，加入1.2 mL DPBS，用TLS-55水平轉(zhuǎn)子4℃下130000×g離心1小時(shí)完成沉淀。而為評(píng)估脂肪衍生的細(xì)胞外囊泡（EVs）在肥胖代謝紊亂中對(duì)脂肪因子分泌失調(diào)的作用。從代謝綜合征患者外周血的血漿分離微囊泡（MVs）和外泌體（EXO）。20mL全血以260×g離心15分鐘后，將富血小板血漿（PRP）與全血分離，并在1500×g下離心15分鐘，得到無(wú)血小板血漿（PFP）。將PFP以21000×g離心45分鐘以沉淀MV。將MV耗盡的PFP Optima MAX-XP超速離心機(jī)轉(zhuǎn)子MLA-50以100000×g分離EXO。在100000×g下兩次1小時(shí)以分離EXO。

       另外，有5個(gè)實(shí)例中的外泌體分離流程中，既使用Optima MAX-XP臺(tái)式超離轉(zhuǎn)頭，也用到SW 40 Ti (6×14 mL)、SW 41 Ti (6×13.2 mL)、Type 70.1 Ti (12×13.5 mL)、Type 70 Ti (8×39 mL)、Type 50.2 Ti (12×39 mL)和Type 45 Ti (6×94 mL) 這些配屬于Optima XPN-100、Optima-LE 80K等立式超速離心機(jī)轉(zhuǎn)頭。3.1.6 牛奶外泌體分離和3.1.8酵母菌外泌體分離純化流程即屬于此情況。

       事實(shí)上，以細(xì)胞培養(yǎng)基為起始材料分離外泌體流程中，使用中等容量超速轉(zhuǎn)頭會(huì)帶來(lái)極大便利。如為檢測(cè)前列腺癌患者血清中前列腺基質(zhì)細(xì)胞衍生囊泡內(nèi)的mRNA。研究人員從患者基質(zhì)組織活檢來(lái)源細(xì)胞培養(yǎng)基和外周血清進(jìn)行了外泌體分離。1）以細(xì)胞調(diào)節(jié)培養(yǎng)基為起始材料的流程中，超速離心用的是立式超速離心機(jī)Type 70 Ti角轉(zhuǎn)子、38.5mL快速密封管以100000×g離心2小時(shí)的方法。2）而1 mL患者血清樣品，是先用大小排阻色譜法分離EVs，再將所有EVs的餾分合并，轉(zhuǎn)移至5mL快速管在TLA-110角轉(zhuǎn)子中100000×g離心2小時(shí)完成的分離。

2、Optima MAX-XP臺(tái)式超速離心機(jī)在外泌體分離應(yīng)用中轉(zhuǎn)頭的使用情況

       將37個(gè)實(shí)例中所有立式超離專用的轉(zhuǎn)頭，按工作容量等效方法轉(zhuǎn)換為Optima MAX-XP臺(tái)式超離轉(zhuǎn)頭，會(huì)更便于我們直觀了解從常規(guī)樣品材料分離外泌體所用轉(zhuǎn)頭的大致情況。因臺(tái)式超離無(wú)法配置單管容量50 mL - 100mL大容量轉(zhuǎn)頭，故6×94mL的Type 45 Ti轉(zhuǎn)頭只用最大容量6×32.4mL的MLA-50替代。

表3 外泌體超速分離中立式-臺(tái)式超離轉(zhuǎn)頭的相互替代對(duì)應(yīng)表

        “基礎(chǔ)流程1”中推薦的轉(zhuǎn)頭以O(shè)ptima MAX-XP臺(tái)式超速離心機(jī)轉(zhuǎn)頭表示，得到的轉(zhuǎn)頭清單是MLA-50、MLA-55、TLA-110和TLA100.3。這說(shuō)明Optima MAX-XP臺(tái)式超速離心機(jī)基本滿足常規(guī)外泌體超速分離操作所需的轉(zhuǎn)頭容量、離心力指標(biāo)工作要求。

       將這37例文獻(xiàn)報(bào)道中實(shí)際使用的立式超速離心機(jī)轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)換處理后，各轉(zhuǎn)頭的使用頻率如圖3所示。                                              

       統(tǒng)計(jì)顯示，這37個(gè)應(yīng)用實(shí)例中的轉(zhuǎn)頭清單與“基礎(chǔ)流程1”對(duì)比后，最顯著區(qū)別在于：使用最多轉(zhuǎn)頭是MLA-55 (8×13.5mL)、TLA-55 (12×1.5mL)和MLA-50 (6×32.4mL)。

       排第二梯隊(duì)的TLA-120.2 (12×2.0mL)、MLA-80 (8×8.0mL)與TLA-100.3 (6×3.5mL)，使用頻率高于TLA-110。

       MLS-50和TLS-55這兩款水平轉(zhuǎn)頭，在外泌體分離流程中應(yīng)用頻率分別明顯不及同等容量范圍的TLA-120.2、MLA-80與TLA-100.3，主要原因在于這兩個(gè)水平轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速、分離效能均不如第二梯隊(duì)三個(gè)轉(zhuǎn)頭。

       如要為Optima MAX-XP臺(tái)式超離在外泌體分離應(yīng)用制定應(yīng)用套裝，MLA-50 (6×32.4mL)+ TLA-100.3 (6×3.5mL)無(wú)疑是一套效率靈活的組合方案。

3、Optima MAX-XP臺(tái)式超離在外泌體分離中離心參數(shù)的設(shè)置

       “基礎(chǔ)流程1”中，外泌體沉淀操作所用的離心力有2個(gè)：100000×g或110000×g。說(shuō)明這兩種離心力下4℃離心1小時(shí)所得到的外泌體組分，通?？梢詽M足下游表征分析和檢測(cè)對(duì)外泌體的產(chǎn)量和品質(zhì)的要求。

       63個(gè)應(yīng)用實(shí)例中，有28例外泌體沉淀步驟設(shè)定的RCF值為100000×g，7例設(shè)置為110000×g，12例用的是120000×g（含118000×g一例），另外13例設(shè)定的RCF從130000 - 259000×g不等，另有兩例未標(biāo)示RCF設(shè)置。

       “基礎(chǔ)流程1”離心時(shí)間要求為：在轉(zhuǎn)頭穩(wěn)定地實(shí)現(xiàn)設(shè)定離心力指標(biāo)下持續(xù)離心滿60分鐘；儀器離心時(shí)間則按不低于70分鐘來(lái)設(shè)置，以保障有效工作離心力下樣品分離時(shí)間。延長(zhǎng)離心時(shí)間到3小時(shí)不會(huì)對(duì)外泌體結(jié)構(gòu)造成損傷。

       有效離心時(shí)間與儀器離心時(shí)間設(shè)定之所以存在區(qū)別，是因所有轉(zhuǎn)頭滿負(fù)荷運(yùn)行時(shí)，由靜止到加速至100000-110000×g工作狀態(tài)以及從工作轉(zhuǎn)速減速直至停止運(yùn)轉(zhuǎn)，即便以最快升降速模式，則一升一降的過(guò)程耗時(shí)超過(guò)約10-20分鐘。轉(zhuǎn)頭工作轉(zhuǎn)速越高、樣品體積越大、加減速設(shè)置越平緩，轉(zhuǎn)頭啟動(dòng)和剎車過(guò)程時(shí)長(zhǎng)更長(zhǎng)。將加減速過(guò)程所占用時(shí)間計(jì)算在內(nèi)，設(shè)定的離心時(shí)間必然超過(guò)70分鐘。

       統(tǒng)計(jì)顯示：63個(gè)應(yīng)用實(shí)例中，30.2%的項(xiàng)目離心時(shí)間設(shè)定為70分鐘，25.2%的實(shí)例設(shè)置為2小時(shí)，不到20%的實(shí)例用的是60分鐘時(shí)長(zhǎng)方案（未說(shuō)明原因）。達(dá)到或超過(guò)3小時(shí)設(shè)定者不到5%?？梢?jiàn)超過(guò)50%的實(shí)例離心時(shí)間設(shè)定范圍為70 – 120分鐘。

表4 外泌體沉淀步驟離心時(shí)間設(shè)定值與實(shí)驗(yàn)案例數(shù)統(tǒng)計(jì)

       “基礎(chǔ)流程1”中所有離心步驟全部在4℃下進(jìn)行。63個(gè)實(shí)例的溫度設(shè)置情況是：28例為4℃，有3例分別為8℃（腦脊液細(xì)胞外囊泡分離）、10℃（從PVA海綿植入物中分離EVs）和25℃（小分子化合物–外泌體結(jié)合率檢測(cè)）。剩余超過(guò)半數(shù)實(shí)例未載明離心溫度條件。

(后續(xù)：Optima Max-xp超速離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的選擇對(duì)外泌體分離效果影響的分析)