一、間接量熱法動物能量代謝分析系統(tǒng)實驗應(yīng)用發(fā)文情況

       19世紀(jì)上半葉，俄國化學(xué)家赫斯（G.H. Hess）從熱化學(xué)研究中得出能量轉(zhuǎn)化與守恒定律（(law of constant heat sums，即熱力學(xué)第一定律）：同一種化學(xué)反應(yīng)中熱和功的總量，只取決于反應(yīng)體系的始、末狀態(tài)，與反應(yīng)的途徑無關(guān)。

       動物的生命是由催化燃燒驅(qū)動的一種復(fù)雜的“生命之火”。根據(jù)Hess定律，低溫生物“火”所釋放的熱量與在彈式量熱儀（bomb calorimeter）中高溫劇烈燃燒等量食物產(chǎn)生的熱量相同。就是說，一般化學(xué)反應(yīng)的基本規(guī)律，同樣適用于人動物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)氧化供能的反應(yīng)。譬如，在動物體內(nèi)氧化1 mol葡萄糖，同在體外氧化燃燒1mol葡萄糖一樣，都是要消耗6 mol O₂、同時產(chǎn)生6 mol CO₂和6 mol H₂O，而且產(chǎn)生的熱量也相等。因此，測定一定時間內(nèi)機體所消耗的食物，或檢測機體所產(chǎn)生的熱量與所做的外功，即可測算出機體單位時間內(nèi)所消耗的能量（energy expenditure/EE，能量代謝率）。

       故測定機體代謝釋放的熱量可有直接量熱法和間接量熱法兩種技術(shù)途徑。

       直接量熱法（direct calorimetry, DC）是測定在特定時間內(nèi)整個機體向外界釋放的總熱量，其中包括在測定期間機體對外所做的機械功（折算為熱量值后一并計入總熱值）。該方法雖然最直接準(zhǔn)確，但所需技術(shù)設(shè)備、實驗條件復(fù)雜，難以實現(xiàn)批量規(guī)?；僮鳌?/span>

       間接量熱法（indirect calorimetry，IC）的理論依據(jù)是能量守恒和物質(zhì)守恒兩大定律：能量代謝的初始底物、最終代謝產(chǎn)物相同，則代謝產(chǎn)生的熱量相同，反應(yīng)消耗的底物（如1 mol葡萄糖）、所需氧氣（6 mol O₂）、最終氧化產(chǎn)物（6 mol CO₂和6 mol H₂O）相同，底物與產(chǎn)物存在定比。間接量熱法無須直接檢測機體所釋放的熱量，而是通過測定釋熱反應(yīng)所消耗O2量、反應(yīng)終產(chǎn)物CO₂（和/或H₂O）的產(chǎn)量，結(jié)合蛋白質(zhì)的消耗比例，通過Weir公式即可計算出代謝過程產(chǎn)生的總熱量。

       間接量熱法測試簡便易行，只需高精度氣體傳感器和小型化簡單艙室即可完成，技術(shù)路線成熟且具有高通量優(yōu)勢。IC不僅特別適合動物實驗采用，也被應(yīng)用于人體代謝監(jiān)測。德國TSE公司PhenoMaster NG Metabolic and Behavioral Phenotyping System（代謝與行為表型系統(tǒng)）、美國Sable公司Promethion Core Behavioral and Metabolic Phenotyping Systems及美國Columbus公司Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS，綜合實驗動物監(jiān)測系統(tǒng))都屬基于IC原理的小動物能量代謝監(jiān)測系統(tǒng)。

       依托這些測試平臺開展實驗的報道，最早見于2009年馬普衰老生物學(xué)研究所&科隆大學(xué)Jens C. Brüning研究團隊關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)TLR-4/MyD88信號傳導(dǎo)通路對飲食誘導(dǎo)肥胖調(diào)控機制研究的論文。國內(nèi)山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院（Sci Rep. 2016）、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院（J Anim Sci. 2018）較早開展了這方面的動物實驗研究，且已有公開成果發(fā)表。                                                  

        (PubMed期刊數(shù)據(jù)庫檢索時間2023-01-03。查詢關(guān)鍵詞為：PhenoMaster[Text Word] AND TSE[Text Word]、Promethion [Text Word] AND Sable[Text Word]、Promethion[Text Word] AND SSI[Text Word]、Oxymax CLAMS[Text Word] AND Columbus[Text Word]；PubDate：～2022-12-31)

       數(shù)據(jù)顯示， 2015年以來，間接量熱法能量代謝分析系統(tǒng)應(yīng)用的實驗發(fā)文開始呈快速增長勢頭。2020-2022三年間，IFoid打分5分以上期刊有關(guān)發(fā)文總數(shù)為448篇。僅2022年，IFoid分大于10.0期刊發(fā)表的上述品牌動物能量代謝分析系統(tǒng)有關(guān)的實驗論文55篇。

表1 TSE、Sable和Columbus品牌動物能量代謝分析系統(tǒng)2022年高分刊文列舉

           (注：IFoid數(shù)據(jù)引自https://sci.justscience.cn)

       這55個采用能量代謝分析系統(tǒng)測試數(shù)據(jù)實驗研究項目，大致可歸入系統(tǒng)代謝調(diào)控、脂肪產(chǎn)熱機制、脂肪代謝疾病等8個方向。其中，米色脂肪（beige adipose tissue）的生成(Qiang Wang, et al. Nature. 2022；609(7925))和代謝產(chǎn)熱（thermogenesis）(Birte Niemann, et al. Nature. 2022；609(7926))、肥胖癥是研究熱點。

       整體能量代謝調(diào)控機制研究則涉及多個維度，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)（如生物鐘、伏隔核）異常、內(nèi)分泌異常（如甲狀腺功能減退）、代謝相關(guān)基因突變（如COX7a2L基因變異）、寒冷暴露、糖皮質(zhì)激素藥物等臨床藥物代謝副作用等。

二、動物能量代謝分析系統(tǒng)核心測試指標(biāo)

       機體依靠呼吸功能從外界吸入0₂供組織細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)氧化分解，為生命活動提供能量，同時將代謝終產(chǎn)物C0₂和H20呼出體外。特定時間內(nèi)，機體能量代謝的二氧化碳產(chǎn)量(carbon dioxide production, VC0₂)與耗氧量(oxygen consumption, VO₂)的比值VC0₂/V0₂，命名為呼吸熵（Respiratory Quotient, RQ）。

       糖、脂肪和蛋白質(zhì)，由于C、H、O三種元素組成比例不同，完全氧化所產(chǎn)生的C0₂、H20與消耗的0₂耗氧量存在巨大差異，RQ值因而各不相同。

       碳水化合物分子中碳和氧的比例相等，氧化時消耗的0₂與產(chǎn)生C0₂分子數(shù)相等。以葡萄糖為例：C₆H₁₂O₆ + 6 0₂ → 6 C0₂ + 6 H₂O，故RQ (glucose) = 6 C0₂/6 0₂ = 1。

       脂肪分子中的氧對碳、氫原子的比例比糖少，故要消耗更多外部提供的氧氣。

       以三油酸甘油酯(triolein)為例：C₅₇H₁₀₄O₆ + 80 0₂ → 57 C0₂ + 52 H₂O，RQ (triolein) = 57 C0₂/80 0₂ = 0.71。

       再如三棕櫚酸甘油酯(Tripalmitin)的氧化：2 (C₅₁H₉₈O₆) + 145 0₂ → 102 C0₂ + 98 H₂O，RQ (tripalmitin) = 102 C0₂/145 0₂ = 0.7。

       蛋白質(zhì)的氧化分解產(chǎn)熱是根據(jù)碳和氫的組成比例計算得到的，RQ理論值為0.80。

       根據(jù)呼吸氣體交換數(shù)據(jù)VC0₂、V0₂，計算出RQ值，代入Weir公示即可獲得代謝能量消耗(energy expenditure, EE)值。

       公式中：EE單位為kcal/h，V0₂單位為L/h，P是蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)能貢獻占總EE的比例（一般情況下，健康機體活動所需熱量供應(yīng)主要源于糖水化合物和少量儲備脂肪氧化，蛋白質(zhì)的氧化供能所占比例近乎于0），V0₂及VC0₂均為按標(biāo)準(zhǔn)溫度/大氣壓/濕度（standard temperature and pressure, dry, STPD)歸一化的校正值。

       有了V0₂、VC0₂，就可實現(xiàn)EE的精確定量。

       小動物能量代謝分析系統(tǒng)的代謝測試指標(biāo)中，常用氣體交換比率(Respiratory exchange ratio, RER)指代RQ，以Heat表示EE。

       ［0₂ concentration］：指輸入測試籠(box or cage)的空氣的0₂分壓，它與輸入對照空測試籠（reference）氣流0₂氧分壓（incurrent fractional oxygen, Fi0₂）完全對等；

       ［dC0₂］：指從測試籠抽取的經(jīng)動物呼吸后，輸出氣流O2氧分壓（excurrent fractional oxygen, Fe0₂）與對照籠輸入氣流的氧分壓之差（FiO2 minus Fe0₂，即ΔF0₂）實測值；

       ［V0₂］：指［dC0₂］轉(zhuǎn)換為以mL/h為單位的計算值；

       ［Flow］、［Temp］：分別指輸入測試籠或從籠中抽吸氣流的流速和籠內(nèi)實時溫度。系統(tǒng)自動將測試氣流中采樣氣體體積進行STPD歸一化處理。

       測試籠氣流流速越大，動物呼吸交換后的C0₂、0₂在籠內(nèi)作無序?qū)α?、擴散和積聚越少，可更有效地被“沖刷”帶出籠外，越有利于消除、降低呼吸交換氣流與測試采樣氣流之間的滯后效應(yīng)，避免因C0₂濃度在籠內(nèi)局部的積聚、擴散影響靜息代謝率（resting energy expenditure, REE.是指機體禁食2h以上并在合適溫度下平靜/臥休息后的靜息能量消耗）、活動代謝率（AEE）指標(biāo)測試準(zhǔn)確性，越易于實現(xiàn)實時監(jiān)測、多指標(biāo)間同步效果。因此，業(yè)界對間接量熱法代謝氣體分析測試有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)：氣流流速需滿足1小時內(nèi)實現(xiàn)4輪測試籠內(nèi)氣體完全更新的要求。有一專用詞匯叫籠時間常數(shù)（cage time constant），是指測試籠內(nèi)氣體全部更新一遍所需的時間。它由籠內(nèi)有效氣體容積、工作氣體流速決定。常數(shù)值小換氣速度快。

       氣流流速應(yīng)針對不同測試籠內(nèi)部容積、有效空間差異進行必要優(yōu)化，以確保達(dá)標(biāo)。資料顯示，Sable Promethion Core系統(tǒng)可實現(xiàn)最高2000ml/min的氣體流速。

       不同測試系統(tǒng)的測試過程中數(shù)據(jù)模塊采集界面、數(shù)據(jù)分析模塊工作界面，所顯示的指標(biāo)略有差異，但后臺控制系統(tǒng)執(zhí)行的采樣參數(shù)基本一致。

        TSE PhenoMaster NG系統(tǒng)的PhenoMaster Software程序界面，V0₂、RER分別以藍(lán)色、綠色曲線呈現(xiàn)。

       從Columbus的Oxymax CLAMS系統(tǒng)的實驗設(shè)置界面可以看出，系統(tǒng)顯示代謝參數(shù)包含了0₂IN（即Fi0₂），0₂OUT（即Fe0₂），D0₂，V0₂，C0₂IN，C0₂OUT，DC0₂，VC0₂，RER、Heat，F(xiàn)low這一系列核心功能指數(shù)。此外，還提供了ACC0₂（0₂累計消耗量）、ACCC0₂（C0₂累計消耗量）兩項指標(biāo)。

       Sable Promethion Core系統(tǒng)代謝模塊實時自動采集每個測試動物的V0₂、VC0₂原始數(shù)據(jù)，計算RQ并實時顯示EE動態(tài)曲線。實驗者可通過系統(tǒng)的電腦工作站本地方式，或通過IM3軟件模塊從移動設(shè)備等遠(yuǎn)程模式，實時操作和堅持、分析V0₂、VC0₂、RQ和EE數(shù)據(jù)。

三、動物能量代謝分析系統(tǒng)的常規(guī)應(yīng)用類型

3.1 動物能量代謝狀態(tài)的監(jiān)測

       通過監(jiān)測的V0₂、VC0₂和EE數(shù)據(jù)結(jié)合動物活動水平數(shù)據(jù)，可以直觀地比較不同實驗干預(yù)分組動物的能量代謝水平。

      如一項由Beth Israel Deaconess醫(yī)療中心&哈佛醫(yī)學(xué)院、西安交通大學(xué)共同完成的關(guān)于PR結(jié)構(gòu)域蛋白16 (PR domain-containing 16, PRDM16)穩(wěn)定性對米色脂肪產(chǎn)生（beige fat biogenesis）的影響及機制研究證實，cullin-RING家族成員CUL2在脂肪細(xì)胞中的過表達(dá)CUL2時，可降低PRDM16蛋白的穩(wěn)定性。CUL2-APPBP2作為泛素 E3 連接酶，催化PRDM16多泛素化。脂肪組織中CUL2–APPBP2表達(dá)升高，通過降解PRDM16蛋白而抑制脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱。而抑制CUL2–APPBP2則可延長PRDM16蛋白的半衰期，并促進了米色脂肪產(chǎn)生。CUL2、Appbp2基因敲除小鼠均可出現(xiàn)PRDM16的多泛素化水平降低，顯著延長PRDM16的半衰期。對脂肪特異性Appbp2-KO小鼠（Adipo-Appbp2-KO）敲除小鼠的代謝表型分析顯示：在正常飲食下，與對照組相比，Adipo-Appbp2-KO小鼠的V0₂增加、呼吸交換比（VC0₂ / V0₂）降低，但未出現(xiàn)體重差異，且表現(xiàn)出適度的高耐寒性。說明在高脂喂養(yǎng)后，基因敲除小鼠的能量消耗顯著高于對照組。因此，研究證實PRDM16蛋白穩(wěn)定可實現(xiàn)代謝健康狀態(tài)的改善、UCP1介導(dǎo)的米色脂肪產(chǎn)熱。

3.2 動物能量代謝底物的分析

       機體的RQ值由特定時間內(nèi)主要能量代謝組份決定。一般情況下，能量來源主要是碳水化合物，RQ=1.00。若動物采用高脂喂食(high-fat diet，HFD)實驗，或正常喂食模式下運動時間過長（如長跑）、劇烈運動或諸如冷挑戰(zhàn)實驗（cold-challenge experiments）這類高熱量消耗，需動用儲備脂肪產(chǎn)熱的條件下，則RQ值低至0.71 - 0.80之間。在長期饑餓情況下，動物體內(nèi)的碳水化合物與脂肪耗竭，或進行實驗動物長期高蛋白膳食(high protein diet，HPD)實驗，機體的能量主要來自蛋白質(zhì)的分解，則RQ≈0.80。

       因此，根據(jù)RQ值可分析特定時間動物機體代謝產(chǎn)生能量所消耗的底物種類。

       測量RQ值可以反映特殊疾病模型、特殊用藥群體的營養(yǎng)狀態(tài)。如糖尿病模型、肌營養(yǎng)不良癥、脂肪營養(yǎng)不良綜合征、腫瘤惡病質(zhì)等，因體內(nèi)脂肪消耗而往往呈現(xiàn)RQ的降低。RQ值回升到0.81 - 1.00，提示營養(yǎng)改善后機體能量代謝逐步恢復(fù)。

參考文獻

［1］Karl J. Kaiyala, Brent E. Wisse, John R. B. Lighton. Validation of an equation for energy expenditure that does not require the respiratory quotient. PLoS One. 2019; 14(2): e0211585.

［2］Qiang Wang, Huixia Li, Kazuki Tajima, et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 2022; 609(7925): 151–158.

［3］Janane F. Rahbani, Charlotte Scholtes, Damien M. Lagarde, et al. ADRA1A–Gαq signalling potentiates adipocyte thermogenesis through CKB and TNAP. Nat Metab. 2022; 4(11): 1459–1473.

［4］Birte Niemann, Saskia Haufs-Brusberg, Laura Puetz, et al. Apoptotic brown adipocytes enhance energy expenditure via extracellular inosine. Nature. 2022; 609(7926): 361–368.

［5］Rafal Czapiewski, Dzmitry G. Batrakou, Jose I. de las Heras, et al. Genomic loci mispositioning in Tmem120a knockout mice yields latent lipodystrophy. Nat Commun. 2022; 13: 321.