應(yīng)用驅(qū)動(dòng)型qPCR儀選型攻略-9

一、TaqMan Array Card的工作特點(diǎn)

       TaqMan探針低密度陣列(TaqMan low-density array，TLDA)，即TaqMan探針陣列卡(TaqMan Array Card，TAC)，是依托5’-端核酸酶水解原理TaqMan探針和實(shí)時(shí)定量PCR儀這一技術(shù)平臺(tái)、采用特殊生產(chǎn)工藝和結(jié)構(gòu)制成的384孔檢測(cè)板（為方便表述，下文統(tǒng)一使用TAC簡(jiǎn)稱）。

       TAC于2003年9月隨ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System一同推出，主要用于高通量基因表達(dá)的定量分析。最早被命名為TaqMan Array Micro Fluidic Card（微流體芯片）。目前的賽默飛官方文件和國(guó)外刊文中，已很少使用Micro Fluidic Card的名稱。檢索2006年1月-2022年2月發(fā)表的TAC應(yīng)用論文發(fā)現(xiàn)， PubMed庫(kù)中“PCR[Text Word] AND TaqMan low-density array[Text Word]”可查到1292條記錄，“PCR[Text Word] AND TaqMan array card[Text Word]”為453條記錄。“TaqMan Array Micro Fluidic Card[Text Word]”則僅1篇文章(因“方法”的同一段落同時(shí)用了TaqMan Low Density Array card 、TaqMan Array Micro Fluidic Card兩種表述)，而“TaqMan Array Microfluidic Card[Text Word]”則查無(wú)記錄。

       其實(shí)，TAC與微流控芯片（Integrated fluid circuit），從結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)到工作液體控制原理都有區(qū)別。一般意義上的微流控芯片多具有復(fù)雜流路結(jié)構(gòu)，測(cè)試所需液體需由微量蠕動(dòng)泵和微量控制閥控制和輸送到反應(yīng)微陣列單元。而TAC的液體流動(dòng)和分配則是通過(guò)人工簡(jiǎn)單離心操作，借助于離心力作用來(lái)實(shí)現(xiàn)每個(gè)樣品通道所轄48個(gè)反應(yīng)孔的液體均勻灌注的。因此，我們建議發(fā)表論文中的關(guān)鍵詞以TaqMan low-density array或TaqMan Array Card為宜。

       每張TAC有8個(gè)獨(dú)立液流通道，每個(gè)通道連通48個(gè)容積1-1.5μL的微量反應(yīng)孔，共384個(gè)孔。所有反應(yīng)孔兩兩對(duì)稱排列于主液流通道兩側(cè)。每個(gè)孔內(nèi)含有為目標(biāo)核酸和質(zhì)控基因定制的高品質(zhì)且標(biāo)準(zhǔn)化生成的正向、反向引物（濃度約900nM）、Taqman探針（200-250nM）凍干后沉積物。

       吸取100μL預(yù)先與TaqMan通用預(yù)混液混勻的DNA或cDNA樣品，經(jīng)TAC每個(gè)檢測(cè)通道加樣口注入液槽中，經(jīng)簡(jiǎn)單密封、離心后，裝入QuantStudio 7 Pro或QuantStudio 7 Flex、ViiA 7或7900HT Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，即可像常規(guī)qPCR反應(yīng)一樣完成擴(kuò)增反應(yīng)與分析。

       與常規(guī)384孔PCR板反應(yīng)體系的構(gòu)建須使用移液工作站或多通道移液器等額外設(shè)備協(xié)助的操作不同的是，TAC上樣只需一支200μL的單道手動(dòng)移液器、一臺(tái)離心機(jī)即可完成上樣方式，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備步驟簡(jiǎn)單，不同反應(yīng)孔分注體積誤差小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致性和重復(fù)性好。

       每張TAC可以同時(shí)運(yùn)行384個(gè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)12-384個(gè)目標(biāo)核酸同步檢測(cè)分析，實(shí)現(xiàn)了常規(guī)單重和多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)難以企及的實(shí)驗(yàn)通量和效率。

二、TaqMan Array Card在生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用

       TAC擁有384個(gè)PCR反應(yīng)通量，一次運(yùn)行可檢測(cè)數(shù)十個(gè)甚至以百計(jì)靶標(biāo)。對(duì)臨床不明原因感染性疾病病原體的快速篩查具有重要價(jià)值。美國(guó)CDC在2011年就開(kāi)發(fā)出集成細(xì)菌、病毒共21種呼吸道常見(jiàn)病原體靶點(diǎn)檢測(cè)TAC，用于社區(qū)獲得性肺炎住院患者中肺炎支原體、病毒感染的鑒別。美國(guó)弗吉尼亞大學(xué)則開(kāi)發(fā)了針對(duì)19種腸道病原體基因的TAC檢測(cè)卡，依托全球腸道多中心研究 (GEMS)計(jì)劃支持，在巴西、東南亞、南亞和非洲等低收入國(guó)家與地區(qū)，大規(guī)模用于小兒腹瀉、腸道炎癥的病原體的檢測(cè)。此外，TAC還被大量應(yīng)用于土壤傳播蠕蟲、血吸蟲病、隱孢子蟲、蛔蟲感染的流行病調(diào)查項(xiàng)目等。 

       TAC的高通量、多靶點(diǎn)同步檢測(cè)特性，賦予它在疾病遺傳分析、基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控機(jī)制研究、疾病診斷/治療/預(yù)后/治療耐藥性的生物標(biāo)志物、生理病理活動(dòng)的信號(hào)通路分析、microRNAs (miRNA）表達(dá)水平、細(xì)胞因子表達(dá)、藥效毒理學(xué)機(jī)制分析、干細(xì)胞分化等諸多領(lǐng)域巨大應(yīng)用潛力，而取得的成果可謂異彩紛呈。 

表1 2016-2021年知名高分期刊刊發(fā)的部分TAC實(shí)驗(yàn)應(yīng)用文獻(xiàn)

        DICER1是一種編碼RNase III的基因，其突變導(dǎo)致miRNA功能失調(diào)極易誘發(fā)多發(fā)結(jié)節(jié)性甲狀腺腫（MNG）、胸膜肺母細(xì)胞瘤（PPB）、卵巢性索間質(zhì)腫瘤（SLCT）等多種腫瘤。用TAC和7900HT Fast 實(shí)時(shí)熒光定量分析系統(tǒng)，對(duì)攜帶突變型（共5個(gè)突變位點(diǎn)）和野生型DICER1基因的MNG、SLCT-MNG患者家族成員的外周血液淋巴細(xì)胞、MNG和SLCT組織中DICER1的miRNA進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明：DICER1突變易導(dǎo)致家族男性罹患MNG，而女性成員對(duì)MNG、SLCT有易感性。 

       孕激素X受體(Pregnane X receptor, PXR)為肝內(nèi)異種生物核受體，協(xié)調(diào)生物轉(zhuǎn)化酶及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能，參與藥物代謝和肝臟解毒過(guò)程。利福平、苯巴比妥等多種化合物均可作為激動(dòng)配體與PXR結(jié)合，進(jìn)而觸發(fā)肝細(xì)胞CYP3A4和CYP2C9藥物代謝酶基因、UGT1A1酶、ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等多種基因的轉(zhuǎn)錄。人類編碼PXR受體基因NR1I2的近端啟動(dòng)子內(nèi)存在雌激素受體、糖皮質(zhì)激素受體α等結(jié)合位點(diǎn)。采用TaqMan Array Human MicroRNA Card，對(duì)肝細(xì)胞的754個(gè)miRNA篩選分析后發(fā)現(xiàn)，利福平治療后miR-18a-5p表達(dá)上調(diào)，但miR-18a-5p上調(diào)會(huì)抑制NR1I2表達(dá)和CYP3A4基因誘導(dǎo)。而糖皮質(zhì)激素不僅通過(guò)啟動(dòng)子區(qū)域上調(diào)NR1I2表達(dá)，還與3′-UTR結(jié)合域上調(diào)NR1I2表達(dá)和下調(diào)miR-18a-5p的表達(dá)。由此揭示了肝細(xì)胞中糖皮質(zhì)激素對(duì)NR1I2表達(dá)調(diào)控的路徑機(jī)制。 

       血清素(serotonin) 即5-羥色胺(5-HT)，參與調(diào)節(jié)攝食、運(yùn)動(dòng)、記憶、疼痛及精神情緒等生理病理過(guò)程。腦干中縫背核（dorsal raphe）聚集了高密度血清素能神經(jīng)元（serotonin neuron）。用定制TAC，對(duì)切除卵巢猴子單獨(dú)用雌二醇或雌二醇+黃體酮治療前后動(dòng)物腦組織中，25個(gè)與DNA修復(fù)和神經(jīng)退行性疾?。∟DDs）相關(guān)基因表達(dá)的變化。這些基因包括：DNA修復(fù)相關(guān)基因（NSB1、NTHL1、LIG4、PCNA、POLG、SHFM1、GADD45A、RAD23A、APEX1、GTF2H5、PARP2、XRCC1、SHRPH）；伴侶蛋白-熱休克蛋白基因（HSP90、HSP70、HSP60和HSP27）；泛素酶（ubiquinases）基因（UBEA5、UBE2D3、UBE3A）；轉(zhuǎn)運(yùn)馬達(dá)蛋白（transport motors）基因（KIF5B、DNCLC1、DCTN4、MAPT）和4個(gè)疾病特異性基因（SCNA、ADAM10、APP和PSEN1）。結(jié)果表明：卵巢類固醇激素對(duì)血清素神經(jīng)元生存能力有益。雌二醇或雌二醇+黃體酮治療增加與DNA修復(fù)、蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)降解、軸突運(yùn)輸和2個(gè)正?；虻谋磉_(dá)相關(guān)的基因表達(dá)（這些基因在神經(jīng)退行性疾病中處于病理狀態(tài)）。表明這些基因?qū)?-HT神經(jīng)元表達(dá)和調(diào)控可能介導(dǎo)了NDDs潛在疾病過(guò)程。 

       缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1α)是細(xì)胞缺氧反應(yīng)的主調(diào)節(jié)因子，特異性誘導(dǎo)microRNA-210(miR-210)表達(dá)上調(diào)，并在介導(dǎo)肺血管組織中的缺氧作用方面發(fā)揮重要作用。但miR-210和線粒體間的作用機(jī)制未知。將人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(human pulmonary arterial endothelial cell, HPAEC) 暴露于0.2%-12% O2條件24小時(shí)作為缺氧細(xì)胞模型，采用TAC對(duì)365種人類miRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示：在HPAECs中，只有miR-210、miR-21、miR-26b、miR-146a、miR-146b、miR-150和miR-328經(jīng)缺氧誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)超過(guò)1.5倍，但只有miR-210的上調(diào)超過(guò)增加25倍并呈現(xiàn)氧依賴式上調(diào)。小鼠PAECs缺氧暴露后miR-210表達(dá)上調(diào)了100倍。Western Blot結(jié)果顯示，0.2% O2暴露HPAECs 細(xì)胞的miR-210水平顯著上調(diào)的同時(shí)，ISCU1/2蛋白水平出現(xiàn)顯著下調(diào)，并持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)缺氧暴露60小時(shí)。提示了miR-210直接抑制ISCU1/2表達(dá)的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，與生物信息學(xué)算法預(yù)測(cè)的鐵硫簇組裝蛋白ISCU1/2是miR-210缺氧細(xì)胞反應(yīng)直接靶標(biāo)的結(jié)論一致。說(shuō)明缺氧時(shí)，miR-210通過(guò)在下調(diào)ISCU1/2的表達(dá)，降低調(diào)節(jié)線粒體功能的鐵硫酶、線粒體復(fù)合體I和烏頭酸酶的比活性。據(jù)此確定miR-210和ISCU1/2在缺氧應(yīng)激期間調(diào)節(jié)線粒體呼吸和代謝的功能和調(diào)控機(jī)制。 

       資料顯示，TAC在信號(hào)通路介導(dǎo)病理變化，藥效毒理評(píng)價(jià)、腫瘤耐藥機(jī)制、干細(xì)胞分化調(diào)控、細(xì)胞因子mRNA表達(dá)譜分析，病理標(biāo)志物篩查和預(yù)后評(píng)價(jià)，基因敲除動(dòng)物模型驗(yàn)證、病毒感染與細(xì)胞免疫機(jī)制等方面應(yīng)用后，所取得的成果不同凡響。

（待續(xù)）