悟凝膠成像儀性能為圖像分析開(kāi)新局-4

四、凝膠成像分析軟件的菌落計(jì)數(shù)分析功能類(lèi)型
       歸納起來(lái)，專(zhuān)業(yè)凝膠圖像分析軟件可提供多種菌落定量分析功能，滿足不同類(lèi)型微生物菌落檢測(cè)需求。
4.1 自動(dòng)計(jì)數(shù)、預(yù)設(shè)模板計(jì)數(shù)和手動(dòng)計(jì)數(shù)
       自動(dòng)計(jì)數(shù)功能（Automatic Counting）：調(diào)整好圖像大小，使用矩形、橢圓、多邊形工具定義分析區(qū)域范圍，選擇"自動(dòng)計(jì)數(shù)"菜單，系統(tǒng)將自動(dòng)完成選區(qū)內(nèi)全部菌落計(jì)數(shù)，并在圖像上顯示。
       與之類(lèi)似，在預(yù)設(shè)模板分析模式（Template Counting）下，調(diào)用預(yù)設(shè)條件模板，軟件將按模板設(shè)置要求自動(dòng)完成菌落分析統(tǒng)計(jì)。
       手動(dòng)計(jì)數(shù)（Click and Add Counting），人工肉眼識(shí)別圖像上的菌落，手工逐一“點(diǎn)選”，被選中的菌落自動(dòng)突出顯示并以數(shù)字標(biāo)示，在完成菌落計(jì)數(shù)后，軟件給出計(jì)數(shù)圖像分布與統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

4.2 顏色分類(lèi)計(jì)數(shù)
       菌落外形特征是辨認(rèn)菌種的重要依據(jù)。細(xì)菌、酵母、霉菌等不同類(lèi)型微生物，在不同培養(yǎng)基上形成外觀特征，如菌落大小、形狀、邊緣、顏色、光澤和透明程度等，存在差異。而同種細(xì)菌、在相同培養(yǎng)條件下形成的菌落特征具有穩(wěn)定性。
       在Identify by Color Counting計(jì)數(shù)模式下，軟件可按顏色區(qū)分不同菌落，并根據(jù)顏色屬性分類(lèi)統(tǒng)計(jì)。一次分析可完成培養(yǎng)皿中不同類(lèi)型菌落檢測(cè)計(jì)數(shù)。
       在定義計(jì)數(shù)選區(qū)，選中第一重顏色菌落后，系統(tǒng)自動(dòng)識(shí)別和計(jì)算所有與采樣點(diǎn)相同顏色的菌落。通過(guò)分類(lèi)添加操作，可進(jìn)一步定義和自動(dòng)分析其他菌落類(lèi)型，直至完成選區(qū)的全部菌落。

4.3 區(qū)帶分析
       區(qū)帶分析（Zone analysis）功能可提供圖像選內(nèi)各個(gè)獨(dú)立菌落分布范圍的面積、直徑大小統(tǒng)計(jì)信息，常用于抗菌和抑菌效果評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中被檢樣品的抑制圈直徑大小的測(cè)量等檢測(cè)。

4.4 選區(qū)排除計(jì)數(shù)
       國(guó)標(biāo)對(duì)于菌落計(jì)數(shù)選區(qū)的選擇有明確技術(shù)要求。
       《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)-菌落總數(shù)測(cè)定》規(guī)定：以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；若成片狀生長(zhǎng)的菌落比例不到平板培養(yǎng)面積的一半,而另一半?yún)^(qū)域菌落分布均勻,則可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2,代表該平板菌落總數(shù)。
       如培養(yǎng)皿的特定區(qū)域圖像有污損，不符合計(jì)數(shù)要求，或?qū)嶒?yàn)者不想將這部分菌落列入最終計(jì)數(shù)結(jié)果中，則可通過(guò)某些在凝膠成像分析軟件的"忽略區(qū)域"命令（Ignore Region），將該圖像區(qū)域排除在計(jì)數(shù)選區(qū)外。
       經(jīng)驗(yàn)人士指出，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)盡量避免在培養(yǎng)皿的底面寫(xiě)字標(biāo)記。除非在計(jì)數(shù)前圖像經(jīng)適當(dāng)處理消除字跡，否則字跡部分會(huì)被錯(cuò)誤地識(shí)別為菌落，干擾計(jì)數(shù)結(jié)果。

4.5 螺旋平板計(jì)數(shù)
       螺旋接種法，是政府微生物專(zhuān)業(yè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)、食品藥品和化妝品生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行樣品菌落總數(shù)檢測(cè)、培養(yǎng)基質(zhì)控中常用接種手段，已被FDA、AOAC、APHA、ISO 7218、我國(guó)GB 4789.28-2013及SN/T 2098-2008等收錄。
       螺旋板計(jì)數(shù)功能，Spiral Counting，正是針對(duì)螺線平板接種法開(kāi)發(fā)的自動(dòng)計(jì)數(shù)模塊。
       執(zhí)行螺旋板分析命令，系統(tǒng)生存一張阿基米德螺旋形網(wǎng)格疊加在計(jì)數(shù)圖像上。移動(dòng)和調(diào)整網(wǎng)格到大小和位置實(shí)現(xiàn)螺旋網(wǎng)格中心與螺旋平板圖像中心準(zhǔn)確對(duì)齊，軟件將顯示螺旋板分析窗口并可自動(dòng)顯示計(jì)數(shù)結(jié)果。

4.6 計(jì)數(shù)條件設(shè)定和修正
       《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）浮游菌的測(cè)試方法》規(guī)定：
       1）須區(qū)分細(xì)菌菌落或培養(yǎng)基沉淀物，剔除被錯(cuò)誤識(shí)別為菌落的圖像背景計(jì)數(shù)；
       2）平板上有2個(gè)或多個(gè)菌落存在重疊，在可有效分辨的情況下應(yīng)按2個(gè)或多個(gè)菌落計(jì)計(jì)算。
       為確保菌落計(jì)數(shù)器或人工計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性、減少誤差，需設(shè)定合理分析條件，且在必要時(shí)執(zhí)行增加/刪除、分割（Split Colonies）/合并菌落（Merging Colonies）操作。
       凝膠成像分析軟件的菌落計(jì)數(shù)模塊，設(shè)置有多個(gè)計(jì)數(shù)條件設(shè)置選項(xiàng)和修正計(jì)數(shù)功能，足以勝任菌落計(jì)數(shù)過(guò)程的質(zhì)控管理任務(wù)。
4.6.1 菌落分割/合并功能
       當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)菌落距離太近而被軟件識(shí)別為一個(gè)菌落時(shí)，可通過(guò)Manual Split Colonies命令手工操作或借助于Auto Split Colonies命令自動(dòng)實(shí)現(xiàn)黏連菌落的分割。
       當(dāng)一個(gè)菌落被錯(cuò)誤地識(shí)別為兩個(gè)獨(dú)立菌落時(shí)，可以通過(guò)Merging Colonies命令手動(dòng)合并兩個(gè)菌落。

4.6.2 菌落圖像強(qiáng)度閾值設(shè)置
       軟件的自動(dòng)計(jì)數(shù)是基于分析對(duì)象與圖像背景的灰度值的差異，如培養(yǎng)皿上菌落比周?chē)鷧^(qū)域更暗或更亮。而圖像強(qiáng)度閾值（Density Thresholds）設(shè)置規(guī)定了分析對(duì)象圖像灰度值的范圍。軟件將圖像中像素強(qiáng)度處于高、低兩個(gè)閾值之間的分析對(duì)象視為細(xì)菌菌落統(tǒng)計(jì)，提高計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

4.6.3 設(shè)置菌落大小尺寸
       圖像分析對(duì)象大小不同，如僅需對(duì)特定大小的菌落計(jì)數(shù)，可使用區(qū)域控制（Area Controls）命令，設(shè)定被統(tǒng)計(jì)菌落的直徑大小范圍，則直徑值處于設(shè)定區(qū)間的對(duì)象視為計(jì)數(shù)對(duì)象。

4.6.4 用直方圖區(qū)分菌落
       凝膠成像分析軟件菌落計(jì)數(shù)模塊，可用直方圖顯示檢測(cè)到的全部菌落圖像信號(hào)強(qiáng)度分布范圍。如果圖像中有白色、藍(lán)色兩種菌落，則直方圖上會(huì)顯示兩個(gè)清晰信號(hào)峰。
       直方圖計(jì)數(shù)窗口設(shè)有控制滑塊，可設(shè)置菌落-圖像背景、白色與藍(lán)色信號(hào)強(qiáng)度值界限。拖動(dòng)滑塊時(shí)，菌落數(shù)量、白色、藍(lán)色菌落的數(shù)量將自動(dòng)調(diào)整。

五、討論
       凝膠成像分析軟件依托自身強(qiáng)大圖像量化分析算法，為菌落計(jì)數(shù)提供了全面的菌落分類(lèi)和量化信息，包括菌落的種類(lèi)數(shù)、每類(lèi)菌落數(shù)量和類(lèi)百分比；菌落整體和每類(lèi)菌落的面積、菌落周長(zhǎng)、菌落平均直徑和菌落圓度(numerically depicts roundness of the colony)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)等。就功能和適用性而言，與全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀難分伯仲。因此，充分發(fā)揮實(shí)驗(yàn)室既有凝膠成像分析平臺(tái)資源，開(kāi)展常規(guī)微生物菌落計(jì)數(shù)工作，科學(xué)合理，簡(jiǎn)便易行。
       無(wú)須諱言，不同品牌凝膠成像分析系統(tǒng)軟件集成的菌落計(jì)數(shù)功能模塊種類(lèi)、數(shù)量存在區(qū)別，分析條件設(shè)置要求也不盡相同。
       此外，凝膠成像分析系統(tǒng)自身硬件條件所限，無(wú)法使用新型自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀裝備的暗視野底部透射光源（下光源），菌落表面立體細(xì)節(jié)呈現(xiàn)效果不佳。部分機(jī)型LED反射白光色溫偏冷，一定程度上影響對(duì)菌落真實(shí)色澤的還原。

參考文獻(xiàn)
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