光致漂白是熒光團(tuán)由于光引起的破壞而失去熒光的現(xiàn)象。這導(dǎo)致在對(duì)樣品成像時(shí)熒光和信號(hào)的損失。

當(dāng)適當(dāng)波長(zhǎng)的光入射到熒光團(tuán)上時(shí)，它會(huì)從基態(tài)躍遷到激發(fā)的單重態(tài)和三重態(tài)階段。在其激發(fā)態(tài)下，它可能與其他分子相互作用并經(jīng)歷永久性共價(jià)修飾。

而且，與單重態(tài)相比，三重態(tài)的壽命更長(zhǎng)，這使其更易于與其他分子相互作用。每個(gè)熒光分子在激發(fā)和發(fā)射之間的這些循環(huán)總數(shù)取決于其結(jié)構(gòu)和周?chē)木植凯h(huán)境。 

基于這些參數(shù)，某些熒光團(tuán)可以快速漂白，而另一些熒光團(tuán)可以在漂白之前經(jīng)歷數(shù)千次激發(fā)和發(fā)射循環(huán)。

減少光漂白的方法

降低光強(qiáng)度

降低光的強(qiáng)度可以減少熒光團(tuán)對(duì)光的暴露，從而減少其經(jīng)歷的激發(fā)發(fā)射循環(huán)。這最終減少了與其相關(guān)的光致漂白。但是，降低光強(qiáng)度也會(huì)降低信號(hào)強(qiáng)度。因此，應(yīng)在實(shí)現(xiàn)正確的信號(hào)強(qiáng)度和最小化光漂白之間取得正確的平衡。

減少曝光時(shí)間

這是降低光漂白效果的另一種方法。在這種情況下，減少曝光時(shí)間將減少熒光團(tuán)經(jīng)歷激發(fā)-發(fā)射循環(huán)的次數(shù)，從而減少光致漂白。這可以通過(guò)減少激光的像素停留時(shí)間或固定更快的成像幀/秒速率來(lái)實(shí)現(xiàn)。

另一種方法是限制成像區(qū)域。這可以通過(guò)固定一個(gè)較小的目標(biāo)區(qū)域并在對(duì)該區(qū)域成像后繼續(xù)移動(dòng)到相鄰區(qū)域來(lái)實(shí)現(xiàn)。

添加防褪色劑

防褪色劑是可以降低光漂白效果的試劑。這些是封固劑，在免疫組化的所有步驟之后，在成像前的最后一步中使用。

使用其他染料

不同的染料或熒光團(tuán)具有不同的光漂白性能。例如，與綠色熒光蛋白相比，紅色熒光蛋白更容易發(fā)生光漂白。因此，改變選擇的染料并使用一種更耐光的染料也可以用來(lái)減少樣品的光漂白。

使用中性密度濾鏡

使用中性密度濾光片還可以減少入射到樣品上的光或光子數(shù)。這也可以減少樣品對(duì)光的暴露并減少光致漂白。同樣，這也可以降低樣品的信號(hào)。

解決此問(wèn)題的一種方法是增加光電倍增器的增益功能。但是，增加此功能也會(huì)增加噪聲以及圖像信號(hào)。因此，應(yīng)在信噪比和光漂白之間達(dá)到適當(dāng)?shù)钠胶猓垣@得最佳圖像。

光漂白的用途

當(dāng)樣品包含由于內(nèi)源性熒光團(tuán)而自然發(fā)出熒光的細(xì)胞物體時(shí)，自發(fā)熒光是一種現(xiàn)象。這些組織或細(xì)胞器通常以與常用熒光團(tuán)相似的波長(zhǎng)發(fā)出熒光，例如綠色熒光蛋白（GFP）或異硫氰酸熒光素（FITC）。這增加了在區(qū)分實(shí)際信號(hào)和來(lái)自?xún)?nèi)源熒光團(tuán)的信號(hào)時(shí)的誤差。在這種情況下，可以將光漂白用作工具。可以將圖像暴露在紫外線(xiàn)下兩個(gè)小時(shí)，以漂白內(nèi)源性熒光團(tuán)，然后用適當(dāng)?shù)墓馓禺愋詿晒獾鞍祝ɡ鏕FP）對(duì)樣品進(jìn)行成像，以降低自發(fā)熒光作用。